牦牛GPR41基因遗传多态性与生长性状关联性研究

2019-02-28王吉坤柴志欣信金伟钟金城

中国畜牧杂志 2019年2期

郝军，王吉坤，柴志欣，王会，信金伟，钟金城*

（1.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川省重点实验室，西南民族大学，四川成都 610041；2.西藏自治区农牧科学院省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏拉萨 850009）

牦牛（Bos grunniens）是一种主要分布在以青藏高原为中心及其毗邻的高山、亚高山地区的特有畜种[1]，是唯一能适应青藏高原高寒牧区恶劣生态环境而生存至今的家养牛种，为当地农牧民提供肉、乳、毛、皮等重要生产生活资料，被誉为“高原之舟”[2]。

孤儿型G蛋白偶联受体（Gprotein-Coupled Receptor41，GPR41）是短链脂肪酸的受体之一[3-4]。短链脂肪酸能够为反刍动物提供75%的能量[5]，可激活GPR41调节脂肪代谢[6]。牛GPR41基因主要包含3个外显子和2个内含子，定位于牛18号染色体，该受体在人、鼠、牛、羊等物种间高度保守[7]。近年来，相关研究表明GPR41基因对机体内脂肪形成和肠道营养吸收具有重要的调节作用。Zaibi等[8]研究发现，GPR41基因在小鼠脂肪组织中表达并通过Gai介导短链脂肪酸刺激瘦素分泌，促使脂肪和能量代谢。Meza-Cuenca等[9]肥胖大鼠腹部脂肪细胞中GPR41 mRNA的表达较对照组显著增加，说明GPR41在脂肪形成过程中发挥重要作用。马娜娜等[10]用高精料日粮饲喂奶牛，发现瘤胃和盲肠组织中GPR41表达量显著提高。以上研究均揭示了GPR41可能对家畜肉品质或能量代谢起关键作用，而肉品质性状和能量代谢也是家畜生长性状的变相体现，筛选对牦牛生长发育有利的候选基因，对促进当地畜牧业经济发展具有重要社会价值。

截止目前，关于牦牛GPR41基因的研究尚未见报道。本研究利用PCR- RFLP分子遗传标记检测GPR41基因多态位点，分析其SNPs不同基因型对牦牛生长性状的影响，为牦牛品种改良和选育工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取健康的麦洼牦牛（50头）、申扎牦牛（47头）和类乌齐牦牛（28头），采集耳组织，75%乙醇保存，带回实验室，-80℃保存备用。在采集样品时，对牦牛的体重、体高、体斜长、胸围、管围等生长指标进行测量记录。

1.2 基因组DNA提取用动物组织DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取基因组DNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，-20℃冻存备用。

1.3 引物设计与PCR扩增参考GenBank中牛GPR41基因序列（NW_003104465.1）的外显子区域，利用Primer 5.0软件设计2对特异性引物（表1），对外显子1和2区域分别进行扩增，引物送英潍捷基（上海）生物科技有限公司合成。

PCR反应体系为25 μL：上、游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板1.0 μL，Taq mix（2×）聚合酶12.5 μL。PCR扩增条件（外显子1）：95℃预变性 4 min，94℃ 变性 30 s，56.3℃ 退火 30 s，72℃延伸20 s，33个循环，72℃再延伸8 min，4℃保存。PCR扩增条件（外显子2）：95℃预变性4 min，94℃变性45 s，51.2℃退火30 s，72℃延伸1 min，33个循环，72℃再延伸8 min，4℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将上述PCR产物扩增纯化后送到英潍捷基（上海）生物技术有限公司进行测序。

1.4 PCR-RFLP分析酶切反应体系为20 μL：限制性内切酶 Hpy 99I 0.5 μL，10×Buffer 2 μL，PCR 产物 17.5 μL，65℃水浴15 min，酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像系统判断酶切结果并进行基因分型。

1.5 统计分析根据PCR-RFLP检测结果，对不同基因型个体进行统计，用以数据分析。利用Pop Gene 32统计软件进行χ2独立性检测、基因纯合度（Ho）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）分析；使用SPSS 24.0软件中GLM程序对不同基因型间生长性状进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果对麦洼、申扎和类乌齐牦牛GPR41基因外显子1、2区域进行PCR扩增，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其扩增产物大小与目的片段大小一致（图1、图2），特异性良好，可用于后续实验。

图1 3个牦牛类群GPR41基因外显子1 PCR扩增

图2 3个牦牛类群GPR41基因外显子2 PCR扩增

2.2 GPR41基因测序和PCR-RFLP分析结果在3个牦牛类群GPR41基因外显子1区域均未发现突变位点；在麦洼牦牛GPR41基因外显子2区域也未发现SNPs，而申扎和类乌齐牦牛GPR41基因外显子2区发现1个突变位点，在4 570 bp处（与原序列相比），碱基由G突变为A，编码氨基酸未发生变化，属同义突变。对申扎和类乌齐牦牛GPR41基因外显子2 PCR扩增产物用内切酶Hpy 99I进行酶切发现3种基因型，命名为AA、AG、GG（图3）。

2.3 遗传多态性分析

2.3.1 基因型频率和基因频率由表2可知，申扎牦牛中，AA型基因型数目最多，属于优势基因型，A为优势基因。类乌齐牦牛中，GG型为优势基因型，G为优势基因。GPR41基因在申扎牦牛中χ2值达到极显著水平，不符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01），推测该突变位点受到人工选择、基因突变等因素影响；类乌齐牦牛群体中χ2值为3.784，符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。

表1 GPR41基因引物信息

表2 GPR41基因在3个牦牛品种中的基因型频率和基因频率

图3 牦牛GPR41基因PCR-RFLP酶切图

2.3.2 GPR41基因 Ho、He、Ne及 PIC 分析由表 3可知，GPR41基因突变位点在2个牦牛类群上的PIC分别为0.37和0.28，均属于中度多态，且申扎牦牛遗传多样性较类乌齐牦牛高。

表3 2个牦牛品种GPR41基因遗传多态性参数

2.4 GPR41基因不同基因型与生长性状关联分析由表4可知，GPR41基因不同基因型对申扎牦牛体重和体高有显著影响，且GG型均显著高于AA型（P＜0.05）；而GPR41基因不同基因型与类乌齐牦牛各体尺性状不相关（P＞0.05）。

3 讨论

GPR41是孤儿型G蛋白偶联受体家族中的成员，它是短链脂肪酸的受体蛋白，能够参与调控多种生理功能。有研究者发现，在山羊原代乳腺上皮细胞中，GPR41可显著上调乳脂代谢相关基因 SREBP1、PPARG、INSIG-1、FABP3、SCD1的表达，从而影响乳腺脂代谢[11]。通过建立表达GPR41受体的细胞株参与丁酸诱导的生化生理过程，发现GPR41对丁酸酯的抗增殖、促凋亡作用有抑制作用，可知GPR41与组蛋白乙酰化相关，可能参与细胞增殖、凋亡和细胞周期等乙酰化相关调控[12]。组织表达方面，GPR41在人体回肠和结肠等组织中表达[13]；另外，在大鼠、兔、山羊、猪等物种的脑、心脏、脾脏、脂肪和结肠中也发现了GPR41的表达[14-17]。迄今为止，对于GPR41基因的研究主要集中在细胞和脂质调控功能以及组织表达方面，而GPR41基因多态性与体尺性状关联性的研究仅有1篇报道。随着中国肉牛产业的迅速发展，尽快缩短牦牛与肉牛产业的差距，寻找优良合适的分子育种辅助标记变得尤为重要。

本研究在申扎牦牛和类乌齐牦牛GPR41基因外显子2区域发现多态位点，第4570位（与原序列相比）发生碱基G→A突变，为同义突变。与王永安[18]在黄牛品种中发现的GPR41基因A498G突变位点存在差异，可能与牦牛自身的遗传背景有关。通过酶切检测发现共有AA、AG和GG 3种基因型。而在麦洼牦牛中仅检测到GG型，可能是其他几种基因型由于频率过低而没有在所选定的牦牛群体中出现，还可能因选择的样本量较小，受随机遗传漂变影响所致。χ2适应性检测显示，申扎牦牛基因型分布不符合Hardy-Weinberg平衡，可能受遗传漂变或人工选育等因素影响；类乌齐牦牛处于Hardy-Weinberg平衡。PIC分析表明，申扎和类乌齐牦牛均表现为中度多态，说明这2个品种都具有选育潜力。通过分析不同基因型与牦牛生长指标的关联性可知，GPR41基因突变位点不同基因型对申扎牦牛体重和体高有显著性影响，而该位点的多态性与类乌齐牦牛的生长指标无明显相关性。本研究中同一SNP多态性对不同牦牛群体中各项生长指标影响有所差异，可能因为不同品系之间的遗传背景存在差异，还可能与选择的样本量较少有关。今后的育种工作中，需要扩大群体数量、开展较大规模的屠宰及肉品质测定研究，进一步确定GPR41基因与生长性状的相关性，以便加快牦牛品种的选育工作。