I期非小细胞肺癌发生淋巴结微转移的检测与预后研究进展

赵炜杰，赵光强综述，叶联华审校

0 引 言

肺癌是恶性肿瘤中发病率和死亡率最高的肿瘤之一，其中，非小细胞肺癌是肺癌最常见的类型，其发病率占所有肺癌的80%～85%［1］。然而，即使行肺癌全切除手术（包括肿瘤全切除加系统性淋巴结清扫）的I 期NSCLC 患者，术后复发或转移的几率仍然高达25%～30%［2-3］，提示这些患者很有可能发生了微转移。随着现代分子生物学技术的发展，微转移得以更加快速和精确地检测并应于临床研究，并成为现代精准医学的研究热点之一［3-4］。近年来研究发现微转移在肿瘤的转移和复发中发挥关键作用，是I 期NSCLC 患者死亡的主要原因。本文从淋巴结微转移的概念、临床检测方法和检测标记物、以及对预后和辅助治疗等方面的作用作一综述。

1 微转移的概念和意义

肿瘤的微转移，又称隐匿性转移，一般是指原发肿瘤被根治后，仍有少量肿瘤细胞扩散并依存于淋巴管、骨髓及外周血液循环中，尚未形成显性转移结节。使用常规影像学检查方法如（CT、B 超、骨扫描等）以及病理学检查等均难以检测发现的隐性微转移［5］。由于淋巴结转移是大多数恶性肿瘤转移复发以及评估预后的重要参考指标，因此，相较于骨髓及外周血，检测淋巴结微转移更为重要。

淋巴结微转移，可参考美国癌症联合委员会（AJCC）的诊断标准：在常规病理检查阴性的淋巴结中检测到单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团的最大直径＜0.2mm 即发生了淋巴结微转移［6］。对肺癌患者术后淋巴结标本进行单张石蜡切片及HE 染色是实际操作中诊断淋巴结转移最常规的方法，这些残留的肿瘤细胞极易被正常淋巴组织掩盖或遗漏。因此需要运用分子生物学及免疫组化的技术进行进一步的检测［7］。

2 非小细胞肺癌淋巴结微转移的检测方法及常用标志物

2.1 HE 染色HE 染色是目前临床上诊断淋巴结转移最常用的方法，具有简便、易操作等特点，但是这种方法由于取材部位的局限以及不同病理医师技术水平不同的主观因素等因素，可能会漏掉淋巴结组织中的微转移病灶。解决的方式是对单枚淋巴结进行连续切片来避免漏诊，但有文献报道对单枚癌的淋巴结标本连续切片30次后，常规病理检查仍有漏诊存在。

2.2 免疫组化法（immunohistochemistry, IHC）IHC 是通过免疫学抗原抗体反应，利用显色剂对组织细胞内的抗原进行标记，从而实现对目标组织细胞的检测。这种检测方法简便，价格相对便宜，敏感度达10-5～10-6，故目前多数学者采用IHC 法进行肺癌微转移的研究。采用IHC 法检测肺癌微转移的常用分子标记物有细胞角蛋白家族、组织多肽性抗原、癌胚抗原和上皮特异性抗原等［7］。但由于组织特异性蛋白抗原，如细胞角蛋白广泛分布于上皮肿瘤，因此在检测过程中可能出现假阳性，同时由于缺乏规范诊断标准，需要连续切片增加可行性，增加了检测工作的复杂性。

2.3 逆转录聚合酶链反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)RTPCR 是通过提取组织标本中的RNA，采用其中的mRNA为模板通过反转录和进行PCR扩增来获得目的基因，通过与肿瘤标记物的mRNA 进行对比来证实肿瘤细胞存在。无需对标本进行连续切片是该方法的优势，敏感性高达10-6～10-7，但由于外环境中RNA 不稳定易污染，也可能导致检测结果假阳性率的升高，但RT-PCR 依旧是理论上诊断标本微转移最可靠方法。PCR 常用的标记物有肺组织特异性蛋白、粘蛋白-1和端粒酶逆转录酶等［8］。

2.4 流式细胞术（flow cytometry，FCM）FCM是使用流式细胞仪使用单克隆抗体、激光和计算机扫描等技术检测标本悬液中的细胞，记录抗原抗体结合时发出的荧光，可以短时间内对大量细胞进行分类收集的技术。FCM 具有快速，准确性好的优点，并可以实时发现检测到的淋巴结微转移。FCM 由于价格昂贵且存在一定的假阳性限制了其应用。

2.5 蛋白免疫印迹和基因表达谱蛋白免疫印迹是根据抗原抗体的特异结合，检测标本中目的蛋白的方法，在特异性和灵敏度方面优势明显。基因表达谱技术是采用cDNA 或核苷酸片段作探针制成芯片，用不同的荧光分子标记待测标本与对照样品的mRNA 后与芯片杂交，通过记录二者与芯片探针杂交的荧光强度来比较基因的表达水平。上述几种方法均为新学科，可靠性高，操作简便。缺点是需要专用检测设备、不易普及、价格昂贵等。

3 淋巴结微转移对预后的影响

第八版肺癌肿瘤-淋巴结-转移（tumor-node-metastasis，TNM）分期更加细分了肺癌的分期标准。但淋巴结微转移等危险因素并未纳入目前的TNM分期系统，对Ⅰ期NSCLC 的预后实现精准预测还存在局限性，有关I 期非小细胞肺癌微转移对患者的总生存期（overall survival，OS），无病生存期（disease free survival，DFS），无复发生存期（relapse free survival，RFS）的影响目前仍然存在争议。

3.1 淋巴结微转移对非小细胞肺癌OS 和DFS 及RFS 的影响为了明确早期非小细胞肺癌患者发生淋巴结微转移对预后的影响，Deng 等［9］筛选了1996-2016年已经发布的8篇相关论文，发现在常规病检阴性淋巴结中微转移的发生率为15.7%～44.9%。存在淋巴结微转移患者的OS 与DFS 较无微转移患者差，其合并HR 值分别为1.98（95%CI，1.50～2.62；P＜0.01）和2.34（95%CI，1.67-3.27；P＜0.01）。提示发生淋巴结微转移与肿瘤复发和患者的预后有关，对于术后淋巴结病理检查阴性的早期NSCLC 患者也需要仔细随访。杨燕君等［10］以CK20和MUC1 作为标记物采用RT-PCR 法检测117 例pN0 期接受肺癌完全切除术后区域淋巴结的微转移，持续随访11～75 个月，中位随访时间44 个月，评估淋巴结微转移与患者长期生存的关系，淋巴结微转移检出率21.37%（25/117），发现淋巴结微转移组生存率明显低于无微转移组（χ2=4.127，P＜0.05）Lafuente-Sanchis 等［11］研究结果提示I 期NSCLC 患者发生前哨淋巴结微转移与预后之间无显著相关性。国内外研究认为，部分通过淋巴管转移的肿瘤细胞能激活机体的免疫应答，这些肿瘤细胞可以在机体的免疫监视下被抑制而保持静止状态多年，其中自然杀伤细胞介导的细胞免疫对肿瘤细胞监视作用最明显［12-13］。研究结果的矛盾性一方面与Meta分析本身的局限性、各研究组的研究条件不同（检测指标不尽相同）有关，另一方面有研究认为只采用一种肿瘤标记物检测肺癌微转移的效果并不理想，所以多数研究者开始探索新的标记物或结合使用多种肿瘤标记物进行检测微转移及肺癌早期诊断，以提高诊断的阳性率［14-15］。Ren 等［16］的研究结果再次证实了淋巴结微转移对患者生存期影响。常规病检阴性淋巴结的NSCLC 患者中，阴性组与微转移组相比，患者的RFS 及OS 明显改善（5 年RFS：80%vs 25%，P＜0.01；5 年OS 87%vs 43%，P＜0.01），而淋巴结微转移患者在RFS及OS方面优于N1期患者（5年RFS 25%vs 8%；P=0.010）和OS（5 年OS：43%vs 20%；P＜0.01）。

3.2 不同区域淋巴结发生微转移对于患者的预后的影响。研究统计显示，不同区域的淋巴结如肺门区（N1）及纵隔区（N2）发生淋巴结微转移对患者的预后也存在差异。Jiang 等［17］对某三级医院所有病理诊断为鳞状细胞癌的患者行解剖性肺切除和系统纵隔淋巴结清扫的全部数据库进行回顾性收集，建立了一种NSCLC 区域淋巴结隐匿性转移的预测模型，提示N2淋巴结的隐匿性转移对治疗和生存至关重要。Martin 等［18］纳入多机构502 例临床I 期（T1-2N0M0）NSCLC 患者的前瞻性试验中显示NSCLC患者N2区域淋巴结中微转移的存在与OS降低有关，而N1 区域淋巴结微转移与OS 与DFS 无明显相关。陆薇等［19］应用IH 对68 例I 期NSCLC 患者术后区域淋巴结进行检测，并进行术后生存随访。结果显示N2 区域发生微转移患者的生存时间（40.2个月）明显低于N1 区域发生微转移患者（62.5 个月），N2 区域发生微转移和N1+N2 区域发生微转移患者的生存时间（36.6 个月）差异没有统计学意义（P＞0.05），而仅N1区域发生微转移与未发生微转移患者生存时间（64.8 个月）差异不明显，结果表明N2区域微转移的患者生存时间较短，是影响患者预后的主要原因。

张浩业等［20］对54 例I 期NSCLC 患者淋巴结进行检测，结果显示8例N1区域阳性患者与36例微转移阴性患者的生存曲线对比，差异无统计学意义（χ2=0.264，P=0.608），6 例N2 区域阳性患者与微转移阴性患者对比，差异有统计学意义，（χ2=7.282，P＜0.01），显示N2 区域发生淋巴结微转移是患者预后不良的危险因素，提示在临床工作中，注意检测N2区域淋巴结微转移对于指导患者进行个体化的治疗以及改善预后有重要意义。

Gwóźdź 等［21］对75 例病理I 期NSCLC 患者行经颈纵隔扩大淋巴结切除术及肺根治性切除术，9 枚纵隔淋巴结（9.3%）检测出微转移，该组患者的5 年DFS 和OS（21.4%）低于阴性组（61.8%，P＜0.01），再次说明纵隔淋巴结中微转移的存在与I期NSCLC 患者OS和DFS下降有关。

3.3 I 期NSCLC 患者发生淋巴结微转移接受术后辅助化疗是否获益目前对于中晚期的NSCLC患者术后接受辅助化疗已经写入NCCN指南，但许多I期NSCLC 患者即使行肿瘤完全切除术，仍有复发，提示可能存在隐匿性转移。而目前的指南中对存在隐匿性转移的I期患者，没有辅助治疗的候选方案。

考虑到即使I 期的患者也有可能存在微转移，West 等［22］认为应对所有NSCLC 根治术后的患者进行辅助化疗。欧阳伟炜等［23］研究结果也显示，淋巴结微转移对于淋巴结微转移阳性患者术后的辅助治疗可获益，术后放化疗对于提高生存有益，但无统计学意义（P=0.063）。国外有研究通过检测肿瘤细胞的游离DNA（ctDNA）来识别肺癌术后患者体内的微转移，指出未来可以通过检测ctDNA 来对早期微转移的患者进行个体化的辅助治疗可能获益［24］。王启鸣［25］指出ctDNA 可能成为未来精准医学背景下预测化疗疗效的研究方向。

Woodard 等［26］采用国际认可的14 基因（BAG1，BRCA1，CDC6 和ERBB3 等）对100 例IA 期、IB 期和IIA 期非鳞状非小细胞肺癌患者进行前瞻性风险分层，比较接受或不接受辅助化疗的高危患者的无病生存（DFS），48 例（48%）患者经分子检测为高危，并将它们分配到观察组和接受辅助化疗组，发现未接受辅助治疗的高危患者5 年DFS 估计为48.9%，接受化疗的高危患者5 年DFS 估计为91.7%（P＜0.01）。接受辅助化疗的I 期NSCLC 患者5 年的DFS 明显高于未接受辅助化疗组。这项前瞻性研究初步证明对早期非鳞状非小细胞肺癌的高危患者，进行术后辅助化疗，可以预防肿瘤复发，改善预后。

4 展 望

近年来，对NSCLC 淋巴结微转移的研究已经取得了一定的进展，但是目前研究还存在着许多不足，目前大多数为回顾性研究，前瞻性研究甚少，发生淋巴结微转移对于患者远期预后仍不明确；对于发生微转移的I期NSCLC 患者缺乏统一的早期干预方案，缺乏多中心协作的权威性研究。因此，应进一步研究I 期NSCLC 淋巴结微转移与预后的关系，对今后将I期NSCLC 淋巴结微转移的检测用于指引临床诊疗，精准判断预后以及对高危患者进行早期干预具有重要意义。