干旱胁迫对蒙原欧李光合特性及叶肉细胞超微结构的影响

邢钟毓，李连国，郭金丽，张晓艳，李晓艳

(内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

欧李(Cerasushumilis(Bge). Sok)属于蔷薇科樱桃属，是我国特有的野生果树之一，主要分布在我国东北、华北和西北干旱地区。欧李植株矮小，根系庞大，具有极强的水土保持、防风固沙能力，是我国三北地区植被恢复、生态建设的优良果树树种[1]。欧李果实营养丰富，尤其是鲜果含钙量(79.09 mg·100g-1)为水果之冠，适合加工成果酱和果酒；种仁是正宗的中药“郁李仁”；叶片可以制茶，具有较高的经济价值。内蒙古高原是我国野生欧李资源最为丰富的地区，该地区欧李资源具有较为突出的抗旱和抗寒能力。蒙原欧李是内蒙古农业大学欧李科研团队利用内蒙古高原欧李资源进行自然杂交、实生优选培育出来的抗寒抗旱优质丰产系列欧李新品系。

欧李抗旱性及抗旱机理研究受到专家学者们的广泛关注。为了解析欧李的抗旱机理，研究人员采用不同试验材料，通过干旱胁迫处理，测定得出多种生理指标、光合参数和叶绿素荧光变化有差异，最终均表明欧李具有极强的抗旱能力[2-4]。干旱胁迫导致植物光合作用降低，是因为叶片超微结构发生改变，而且超微结构的损伤程度与植物的耐旱性相关[5]。但在干旱胁迫下欧李光合作用变化规律与叶片超微结构的关系还没有相关报道。本研究以蒙原欧李为试材，测定不同程度干旱胁迫下欧李叶片光合参数和叶绿素含量，观察叶肉细胞超微结构的变化，分析蒙原欧李在干旱条件下光合作用下降的原因，为解析欧李抗旱生理机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

蒙原欧李2年生苗，材料来源于内蒙古农业大学欧李科研与示范基地。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 选长势一致的2年生健壮欧李苗，5月份定植于花盆中(上口径×下口径×高：25 cm×18 cm×20 cm)，基质配比为普通园土∶细沙=4∶1，每盆基质7.5 kg，每盆1株，放置于避雨大棚中养护，于生长旺期选取长势一致的盆栽苗按试验设计分批停水进行干旱胁迫处理，9月3号傍晚处理完成，次日上午9∶00-11∶00点集中采样用于各项指标测定。试验设置4个处理：轻度胁迫(LD)无浇水8 d；中度胁迫(MD)无浇水12 d；重度胁迫(SD)无浇水16 d；正常供水(CK)于8月18日傍晚浇透水，以后每4 d于傍晚少量补水一次(根据当天盆重减少情况)。每处理6盆，设置3次重复。

1.2.2 土壤含水量及叶片相对含水量测定 土壤含水量用烘干法测定：土壤含水量(SWC)=(M1-M2)/(M2-M0)×100%，其中，M0为烘干空铝盒质量(g)；M1为烘干前铝盒及土样质量(g)；M2为烘干后铝盒及土样质量(g)。叶片相对含水量采用烘干法测定：叶片相对含水量(LRWC)=(M0-M1)/(M2-M1)×100%，其中，M0为叶片初始鲜重(g)；M1为叶片干重(g)；M2为叶片饱和鲜重(g)。

1.2.3 光合参数测定 在9月4日(晴天)上午9∶00-11∶00 采用便携式光合作用测定系统(CIRAS-3，PP-System公司，美国)，选择欧李植株生长健壮并完全展开的功能叶片(从植株顶端数第25～30片叶)，测定净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和水分利用效率(WUE)。光源为LED，光合有效辐射PAR为1 200 μmol·m-2·s-1，每个处理3次重复。

1.2.4 叶绿素含量测定 叶绿素含量采用80%丙酮提取法[6]。

1.2.5 叶片超微结构观测 取植株顶端数第25～30片新鲜叶片，分别切成大小约为0.5 mm×0.5 mm组织块，迅速投入固定液(0.2 mol·L-1磷酸缓冲液配制2.5%戊二醛)4℃固定4 h。然后用PBS缓冲液冲洗3次，每次1 min。1%锇酸4℃固定2 h后用PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min。乙醇系列梯度(30%、50%、70%、90%、100%)脱水每次10 min，其中100%两次。Epon812环氧树脂包埋，37℃、45℃、65℃温箱固化，每级温度24 h。超薄切片机(Ultracut E，Reichert-Jung公司，奥地利)切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色。透射电镜(JEM-1200EX，Jeol公司，日本)观察，每个样品取10个视野。

1.3 数据分析

采用Excel和SPSS软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析的最小显著差异法(LSD)比较同一指标不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对土壤含水量及叶片相对含水量的影响

随着干旱胁迫程度加重，土壤含水量和叶片相对含水量变化趋势一致，随干旱胁迫时间的延长逐渐降低(图1)。不同处理间差异均达到了显著水平，其中SD处理降幅最大，土壤含水量和叶片相对含水量分别降为CK的21.60%和78.21%(P<0.05)。蒙原欧李在SD处理时依然能保持较高的叶片相对含水量，这与其特殊的叶片结构有关，蒙原欧李叶片狭窄，叶片小而厚，气孔密度大但气孔较小，水分散失的少。

2.2 干旱胁迫对蒙原欧李叶片光合参数的影响

随着干旱胁迫程度的加重，蒙原欧李各光合参数变化趋势明显(图2)。Pn、Tr、Gs、WUE变化趋势一致，即随着干旱胁迫程度的加重各参数值逐渐降低；除Gs在MD处理和SD处理之间差异不显著外，其他参数在不同胁迫处理条件下各处理间均差异显著(P<0.05)。Pn在MD处理时降幅最大，较LD处理下降63.11%，在SD处理时降到最低，为CK的9.09%，说明此时光合作用产生的能量与呼吸消耗的能量基本持平。Tr、WUE与Gs均在SD处理下最低，分别为CK的45.19%、20.39%和3.16%，说明随着胁迫程度的逐渐加重，欧李叶片通过关闭气孔来降低蒸腾速率，以保持叶片水分来抵抗不良环境，这也是欧李植株抗旱的一种表现。

注：图中不同小写字母代表在 0.05 水平上差异显著，下同。Note：Different lowercase letters in the figure represent significant differences at the level of 0.05. The same below.图1 蒙原欧李在不同干旱胁迫程度下土壤含水量及叶片相对含水量的变化Fig.1 Changes of soil water content and relative water content of leaves in Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

图2 蒙原欧李在不同干旱胁迫程度下光合参数的变化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters of Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

Ci与其他光合参数变化趋势相反，随干旱胁迫程度的加重呈逐渐上升趋势。LD处理与CK相比，差异不显著，说明在LD处理下光合机构仍能正常运作；但随着干旱胁迫时间的延长，Ci显著升高，在SD处理时到达最高值，是CK的2倍，而此时Gs达到最低值，说明在SD处理下大部分气孔已经关闭，Ci仍急剧升高可能是由于光合机构受损失去了正常的运作能力。

2.3 干旱胁迫对蒙原欧李叶绿素含量的影响

随着胁迫程度的加重，蒙原欧李叶片叶绿素含量先升后降，各处理间差异显著(P<0.05)(图3)。在LD处理下，蒙原欧李对不良环境出现应激反应，叶片水分减少，叶绿素呈现相对“浓缩”，此时含量达到最高值(3.10 mg·g-1)，与CK相比增加6.59%；随干旱胁迫加重，水分缺失导致蒙原欧李叶片细胞生理机能发生改变，叶绿素合成减少或受阻，分解加快，因此叶绿素含量迅速降低，SD处理下叶绿素含量降至最低(2.77 mg·g-1)。

2.4 干旱胁迫对蒙原欧李叶肉细胞超微结构的影响

2.4.1 干旱胁迫对细胞核超微结构的影响 干旱胁迫程度加大使蒙原欧李叶肉细胞细胞核变的不规则，染色质浓缩，甚至解体消失。CK细胞核呈球形，结构完整，双层膜完整清晰，核质均匀(图4A)；LD处理下细胞核变为不规则球形，核膜清晰，核膜内陷，核质均匀一致(图4C)；MD处理下核质浓缩，核膜变形，外膜模糊，出现部分断裂(图4E)；SD处理下细胞核失去正常结构，严重变形、变小，核膜出现大面积溶解，核内物质流出，几乎解体(图4G)。

图3 蒙原欧李在不同干旱胁迫程度下叶绿素含量变化Fig.3 Changes of chlorophyll content in Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

注：N：细胞核；NH：核膜；CW：细胞壁；PM：细胞质膜；CH：叶绿体；CM：叶绿体膜；Mi：线粒体；G：基粒；SG：淀粉粒；V：液泡；OG：嗜锇颗粒。(A)正常供水细胞核结构×50000；(B)正常供水叶绿体及线粒体结构×50000；(C)轻度胁迫细胞核结构×30000；(D)轻度胁迫叶绿体及线粒体结构×50000；(E)中度胁迫细胞核结构×30000；(F)中度胁迫叶绿体及线粒体结构×50000；(G)重度胁迫细胞核及线粒体结构×30000；(H)重度胁迫叶绿体结构×30000。Note: N： Nucleus；NH： Nuclear hole；CW: Cell wall；PM: Plasma membrane；CH: Chloroplast；CM：Chloroplast membrane；Mi： Mitochondria；G： Grana；SG： Starch grain；V： Vacuole；OG： Osmiophilic granule。(A)The structure of nucleus under normal water supply×50000； (B) The structure of chloroplast and mitochondrial under normal water supply×50000； (C) The structure of nucleus under mild stress×30000; (D) The structure of chloroplast and mitochondrial under mild stress ×50000; (E) The structure of nucleus under moderate stress×30000； (F) The structure of chloroplast and mitochondrial under moderate stress×50000; (G) The structure of nucleus and mitochondrial under severe stress×30000; (H) The structure of chloroplast under severe stress×30000.图4 蒙原欧李在不同干旱胁迫程度下叶肉细胞超微结构变化Fig.4 Ultrastructural changes of mesophyll cells in Mengyuan Cerasus humilis under different drought stresses

2.4.2 干旱胁迫对细胞壁的影响 随干旱胁迫程度增大，蒙原欧李叶肉细胞细胞壁先厚后薄。LD处理下细胞壁最厚(700 nm)，比CK(680.58 nm)厚19.42 nm，MD和SD处理时细胞壁厚度均小于CK，分别为629.42、500 nm。CK及LD处理时细胞壁和质膜清晰，细胞未发生质壁分离(图4B,4D)；MD处理时，部分细胞质膜内陷，出现质壁分离(图4F)；SD处理时质壁分离严重，细胞器崩溃降解(图4H)。

2.4.3 干旱胁迫对叶绿体超微结构的影响 蒙原欧李叶肉细胞叶绿体随干旱胁迫程度加大变化明显，逐渐失去完整结构。CK叶绿体结构完整，呈梭形沿其长轴方向分布于质膜内侧，双层被膜结构清晰完整，基粒片层垛叠整齐有序(图4A，4B)；LD处理下其排列整齐但有轻微肿胀现象，部分基粒类囊体变松散，基粒片层间距变宽，但片层结构清晰可辨，含较多淀粉粒和少量嗜锇颗粒(图4C，4D)；MD处理下叶绿体加剧膨胀，由梭形向圆形变化，外膜模糊，基质片层被拉长变细出现断裂离散现象，呈丝状片层结构，嗜锇颗粒数明显增多、体积变大，有较多大体积淀粉粒，个别叶绿体弯曲有脱离质膜内侧移向细胞中央的趋势(图4E，4F)；SD处理下叶绿体进一步肿胀变形并脱离质膜内侧，内部出现空腔，膜系统结构几乎解体，淀粉粒数量减少，大量嗜锇颗粒流入细胞质(图4G，4H)。

2.4.4 干旱胁迫对线粒体超微结构的影响 随干旱胁迫程度增大，线粒体整体结构变化不大，大部分未见明显破裂。CK线粒体呈圆球或椭球形随机散布在细胞质中，双层膜结构完整，嵴丰富明显，基质浓厚(图4B)；LD处理下嵴出现一定程度断裂(图4D)；MD处理下线粒体膜发生断裂溶解，嵴部分断裂，内腔出现空洞，线粒体变得模糊(图4F)；SD处理下外膜几乎消失，嵴严重减少且基质变稀薄，线粒体模糊不清几近消失(图4G)。

3 讨论与结论

土壤干旱胁迫对植物生长和代谢的影响是多方面的，其中对光合作用的影响尤其突出和重要[7]。从植物本身来说，干旱胁迫导致光合作用的降低受到气孔与非气孔因素的双重影响[8-10]。研究普遍认为，植物在短期逆境条件下光合作用降低主要是气孔限制的作用，植物在干旱胁迫下，为了降低蒸腾作用、保持水分而关闭气孔，从而使Gs降低，蒸腾速率降低，进而引起光合速率的降低[11]。本研究也验证了这个结论，蒙原欧李在LD处理下，Gs下降，叶片气孔关闭以减少蒸发，同时阻碍了外界CO2进入叶肉细胞，Ci变化不明显，导致蒙原欧李Pn降低，这说明此时光合作用的受限主要是由气孔限制引起的。随着胁迫加重，在MD和SD处理下Gs显著降低，但二者差异不显著，而此时Ci显著上升，在SD时达到CK的2倍，Pn降至最低值。说明干旱胁迫程度进一步加重时，气孔不是光合作用降低的决定性因素，蒙原Pn降低可能是因为叶绿体和线粒体光合机构受损无法进行正常的光合作用引起的。为了进一步证实这一结论，对干旱胁迫下的蒙原欧李叶绿素含量进行了测定，结果发现叶绿素含量先升后降，LD时达到最高值，较CK增加了6.59%，这可能是通过增加叶绿素合成保护光合机构不受破坏，维持叶片正常光合作用来抵抗逆境，是蒙原欧李具有较强的抗旱能力的体现。但随胁迫程度加重，叶绿体结构发生变化，叶绿素含量下降，这也是导致光合作用降低的主要原因之一。本研究结论与一些学者研究结果一致，如杨锐等[12]在野生酸枣上的研究，也发现在干旱胁迫下叶绿素含量先升后降，但还有些研究认为叶绿素含量会随着干旱胁迫程度的加深而减少[13]，这可能与研究物种的抗旱能力有关，蒙原欧李和野生酸枣都是抗旱植物的典型代表。

叶绿素含量和光合参数的变化，究其主要原因就是在不同的干旱胁迫处理条件下，植物叶片叶肉细胞超微结构发生不同程度的变化，其中叶绿体和线粒体是对胁迫较敏感且所担负功能较为重要的两个细胞器[14]。本研究发现，在CK处理下叶肉细胞中的叶绿体呈梭形紧贴于细胞壁，叶绿体这种分布方式有利于大气中的CO2向叶绿体中扩散，促进光合作用[15]。随干旱胁迫程度加重，蒙原欧李叶绿体移向细胞中央，由梭形逐渐肿胀变形，基粒片层结构紊乱，双层膜破裂，出现空腔，内容物流出，嗜锇颗粒和淀粉粒明显增多，而叶绿体这些形态变化证明蒙原欧李在干旱胁迫严重时光合机构遭到破坏，导致光合作用降低。与叶绿体相比，线粒体是细胞中较不敏感的细胞器，受害程度较小[16-17]。研究发现，只有在MD和SD处理下蒙原欧李线粒体结构才会遭到破坏，功能降低甚至消失，不能提供转运碳水化合物所需的能量，影响叶绿体光合产物输出，进而导致大量淀粉累积在叶绿体内，形成淀粉颗粒；当叶片中淀粉颗粒量达到一定水平时，淀粉会对类囊体造成机械损伤，引起叶绿体光合速率和光合活性降低[18]。叶绿体和线粒体损伤意味着新陈代谢发生紊乱，引起光抑制，导致光合能力下降，这也是蒙原欧李随着干旱胁迫程度加重光合作用降低的因素之一。

此外，我们研究发现蒙原欧李叶肉细胞在LD处理下的细胞壁厚度(700 nm)要明显高于CK(680.58 nm)、MD处理(629.42 nm)和SD处理(500 nm)，这可能是蒙原欧李在遇到外界环境胁迫时所做出的适应环境的改变，也是欧李抗旱性强的一种表现。吴建慧等[19]在委陵菜属植物研究中也发现干旱胁迫后有细胞壁增厚的现象，但未报道细胞壁厚度与植物抗逆性是否相关，因此需要进一步对蒙原欧李其他品种或资源进行综合分析，准确得出细胞壁增厚能否作为评价欧李抗旱性指标之一的结论。