FOXD2-AS1在肿瘤中的功能与调控机制的研究进展

胡增涛，关沧海，赵俞乔综述，姜兴明审校

0 引 言

癌症在全世界范围内是导致死亡的主要原因之一［1］，虽然外科手术、放化疗及靶向药物等治疗手段已有很大进展，但由于缺乏早期有效的生物标志物，患者被诊断时多处于疾病晚期。随着基因技术的不断发展，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤中的异常表达引起研究人员的重视。LncRNA 是一类缺乏开放阅读框架且长度大于200个核苷酸的非编码RNA，部分lncRNA 已被证实参与增殖、抗凋亡及侵袭转移等肿瘤恶性进程［2］。FOXD2-AS1 作为一种新发现的lncRNA，在多种恶性肿瘤中呈现异常高表达并调控其发生发展。本文对FOXD2-AS1 在肿瘤中的作用与调控机制作一综述。

1 FOXD2-AS1概述

长链非编码RNA FOXD2-AS1 定位于人类染色体1p33，长度2509bp，具有一个外显子但不能编码蛋白质，最初于2015 年肝细胞癌研究中首次被发现［3］。随着研究的不断深入，FOXD2-AS1 被发现在多种恶性肿瘤中呈现过表达且调控细胞增殖、抗凋亡、侵袭迁移等恶性生物学行为，促进肿瘤的发生发展。FOXD2-AS1 的作用机制具有多样性，深入研究有望为肿瘤早期诊治与评估患者预后提供依据。

2 FOXD2-AS1与消化系统肿瘤

2.1 食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）ESCC在全球癌症相关死亡原因中居第6位，虽然治疗手段已取得很大进展，患者的5年总生存率仍低于15%［4］。Bao等［5］应用实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）对147例ESCC 组织及癌旁正常组织进行检测发现FOXD2-AS1 在肿瘤中表达水平异常升高。Kaplan-Meier 分析结果表明，FOXD2-AS1 高表达组患者预后相对较差；多变量Cox分析结果显示：FOXD2-AS1表达与TNM 分期及总体存活率高度相关且FOXD2-AS1 表达与淋巴结转移被确定为ESCC 患者无病存活的独立评估指标。因此，对FOXD2-AS1的深入研究有望为ESCC 的治疗与评估患者预后提供帮助，但其潜在分子调控机制仍有待进一步探究。

2.2 胃癌胃癌是一种预后相对较差、严重危害人类健康的恶性肿瘤，大多数患者由于早期无特异性症状而在疾病晚期才得以诊断［6］。Xu等［7］通过比较微阵列数据集中胃癌组织与正常胃组织的lncRNA谱发现，FOXD2-AS1 在胃癌中表达水平显著上调且FOXD2-AS1 高表达组患者预后相对较差。GEO（gene expression omnibus）数据库中的基因富集分析结果揭示：FOXD2-AS1 的异常高表达与肿瘤细胞内周期调控及DNA 复制marker基因过表达密切相关。细胞实验与动物实验结果表明，FOXD2-AS1 过表达能够促进肿瘤细胞增殖而抑制其表达则导致肿瘤生长显著减缓。RNA-pull down 结果显示，FOXD2-AS1 通过调控果蝇Zeste 基因增强子人类同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）与赖氨酸特异性去甲基化酶1（lysine demethylase 1A，LSD1）的表达推动胃癌发生发展。进一步研究发现肝配蛋白受体B3（EPH receptor B3，EphB3）在胃癌中低表达且现有研究证实EphB3 是受EZH2 与LSD1 调控的下游靶基因［8-9］。拯救实验结果表明，EphB3 能够在体内和体外部分逆转FOXD2-AS1 的促癌作用同时减缓FOXD2-AS1介导的细胞周期推进。此外，吴晓霞等［10］研究发现FOXD2-AS1 在胃癌组织中的表达水平明显高于正常组织且在阿帕替尼耐药细胞株中更为显著；生物信息学分析结果及验证实验结果表明，FOXD2-AS1与miR-185-5p以及miR-185-5p与细胞周期蛋白D2（cyclin D2，CCND2）间均存在靶向关系。上述研究结果提示：FOXD2-AS1 能够通过调控miR-185-5p/CCND2 分子轴促进胃癌恶性进展并诱导胃癌对阿帕替尼耐药。

2.3 肝细胞癌肝细胞癌是导致全球癌症相关死亡的第二大原因［11］。Zhao 等［12］通过对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中肝细胞癌组织与正常肝组织样本进行分析发现，FOXD2-AS1 在肿瘤组织中异常高表达并且FOXD2-AS1 表达水平与患者预后密切相关。Chang 等［13］对140 例肝细胞癌组织及邻近正常肝组织进行检测结果也表明FOXD2-AS1 在肝细胞癌中表达水平显著上升。功能性实验结果显示FOXD2-AS1 过表达能够在体外促进肿瘤细胞增殖与侵袭迁移；皮下成瘤实验结果显示FOXD2-AS1 组肿瘤体积与重量均高于对照组，这表明高表达的FOXD2-AS1在体内同样能够促进肿瘤生长。对其作用机制的研究结果表明，FOXD2-AS1 通过充当miR-206 的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）促进肝细胞癌的发生发展；膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）在肝细胞癌中的表达水平与FOXD2-AS1呈正相关并且miR-206 正是通过下调ANXA2 的表达来抑制肿瘤发生发展。Xu 等［14］发现FOXD2-AS1在肝细胞癌中表达水平上调并且与肿瘤数量及大小呈正相关。流式细胞术、功能丧失以及动物实验结果表明：敲低FOXD2-AS1的表达能够在体外与体内抑制肿瘤生长并诱导细胞周期停滞于G0/G1 期。随后对其作用机制的研究发现：FOXD2-AS1 可与EZH2 结合，后者进一步能够与细胞周期依赖性激酶阻滞基因1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B）的启动子区域结合，敲低EZH2 能够上调CDKN1B 的转录水平，下调FOXD2-AS1 的表达将阻滞EZH2 与CDKN1B 启动子的结合并抑制H3K27me3 修饰；沉默CDKN1B 能够逆转FOXD2-AS1 敲低诱导的细胞周期停滞。除此之外，另有研究发现：EGR1 通过与FOXD2-AS1 的启动子结合来增强FOXD2-AS1 的转录活性；FOXD2-AS1 还能够通过与EZH2 结合进而沉默Wnt 信号通路抑制因子Dickkopf-1（dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1，DKK1）的表达以激活Wnt/β-catenin 信号通路从而推动肝细胞癌发生发展［15］。

2.4 结直肠癌结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，在发达国家发病率较高，但在发展中国家具有更高的死亡率［16］。Yang 等［17］通过对结直肠癌患者组织进行定量检测后发现FOXD2-AS1 在肿瘤中表达水平显著上调。功能性实验结果显示利用siRNA 外源性下调FOXD2-AS1 表达能够抑制肿瘤细胞增殖与侵袭迁移能力。现有研究表明Notch途径参与调控多种肿瘤的发生发展；外源性下调FOXD2-AS1 的表达能够抑制肿瘤细胞中这种信号通路相关标志物的表达。因此，FOXD2-AS1 能够通过调控Notch 信号通路促进结直肠癌的恶性进展。此外，Zhu 等［18］通过对数据库进行分析并进行验证实验发现，miR-185-5p 是受到FOXD2-AS1 调控的下游靶基因，过表达的miR-185-5p 能够抑制FOXD2-AS1 诱导的肿瘤细胞增殖与侵袭迁移；细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，CDC42）是miR-185-5p 的下游靶标并且CDC42 与FOXD2-AS1 在肿瘤细胞中表达水平呈正相关。上述实验结果提示：FOXD2-AS1 通过调控miR-185-5p 进而促进CDC42表达来参与结直肠癌的发生发展过程。

3 FOXD2-AS1与肺癌

肺癌是一种最常见的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%～85%［19］。Rong 等［20］通过分析数据库中NSCLC 相关数据并应用qRT-PCR 对45 例NSCLC 患者组织进行定量检测后发现，FOXD2-AS1 在肿瘤中表达水平异常增高并且与患者术后生存密切相关。噻唑蓝还原实验、流式细胞术与动物实验结果显示，FOXD2-AS1 过表达能够在体外和体内促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡发生；外源性敲低FOXD2-AS1 将抑制肿瘤细胞增殖与集落形成并促进其凋亡。Western blot 实验结果证实：沉默FOXD2-AS1能够抑制肿瘤细胞中β-catenin 与TCF7（transcription factor 7）的表达，而过表达的FOXD2-AS1 则能够诱导两者表达水平上调。拯救实验结果显示，应用Wnt/β-catenin 信号传导激活剂与抑制剂能够反转FOXD2-AS1 敲除与过表达对肿瘤生长的影响。上述研究结果提示FOXD2-AS1 通过激活Wnt/βcatenin信号通路推动NSCLC发生发展。

4 FOXD2-AS1与胶质瘤

胶质瘤是一种最常见的颅内恶性肿瘤，具有非常高的复发率和死亡率［21］。Shen 等［22］进行组织定量检测后发现FOXD2-AS1 在胶质瘤中呈异常高表达；细胞实验与皮下成瘤实验结果证实，沉默FOXD2-AS1 能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭迁移与上皮-间质转化并且促进凋亡发生。荧光素酶实验结果表明，miR-185-5p 受FOXD2-AS1 的内源性海绵吸附调控并且CCND2是miR-185-5p的下游靶基因；同时外源性敲低FOXD2-AS1 将抑制CCND2 的表达，而沉默miR-185-5p 则能够逆转这种抑制作用。此外，FOXD2-AS1 还能够充当miR-185-5p 的海绵来上调高迁移率族蛋白A2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）的表达进而激活PI3K/AKT 信号传导途径从而推动胶质瘤恶性进展［23］。Dong 等［24］对数据库进行分析后发现，FOXD2-AS1 的启动子中存在与环腺苷酸应答元件结合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）的结合位点。进一步研究发现CREB1 在胶质瘤中过表达并参与诱导FOXD2-AS1 的表达上调；过表达miR-185 能够消除FOXD2-AS1转染细胞的荧光素酶活性且两者在胶质瘤细胞中表达水平呈负相关；miR-185与AKT1存在结合位点并且转染miR-185 mimics能够抑制肿瘤细胞内AKT1的表达。上述实验结果提示，CREB1能够上调FOXD2-AS1的表达且FOXD2-AS1通过调控miR-185/AKT1分子轴在胶质瘤中发挥其生物学功能。

5 FOXD2-AS1与膀胱癌

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率在所有恶性肿瘤中排名第9 位［25-26］。Su 等［27］研究证实，FOXD2-AS1 在膀胱癌中异常高表达并且与癌肿分期、肿瘤复发及患者预后高度相关。细胞实验结果表明FOXD2-AS1 能够促进肿瘤细胞增殖和侵袭迁移以及G1/S 转换；皮下成瘤实验结果显示沉默FOXD2-AS1 后移植瘤的体积与重量显著下降。机制研究表明，FOXD2-AS1 通过与假性蛋白激酶3（Tribbles pseudokinase 3，TRIB3）启动子形成RNADNA 复合物来抑制其转录活性进而诱导Akt 磷酸化，磷酸化Akt 能够上调E2F 转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）表达，后续实验进一步证实E2F1 可促进FOXD2-AS1 的高水平转录。上述研究结果提示，膀胱癌中FOXD2-AS1 借助TRIB3/Akt/E2F1 调控轴来促进肿瘤恶性进展并维持自身异常高表达。An 等［28］发现，FOXD2-AS1 在吉西他滨耐药膀胱癌细胞中的表达水平高于非耐药肿瘤细胞。体外与体内实验结果证实，外源性下调FOXD2-AS1的表达能够抑制肿瘤细胞增殖并降低吉西他滨耐药相关基因的表达。生物信息学分析与验证实验结果表明，FOXD2-AS1 通过靶向miR-143 进而正向调节三磷酸腺苷结合转运蛋白C3（ATP binding cassette subfamily C member 3，ABCC3）的表达，从而诱导膀胱癌细胞对于吉西他滨耐药。

6 FOXD2-AS1与头颈部肿瘤

6.1 鼻咽癌鼻咽癌是一种常见的头颈部肿瘤，在中国南方与东南亚地区具有极不均匀的地域性分布，患者的五年生存率约为76%～80%［29］。Chen等［30］进行定量检测后发现FOXD2-AS1在NPC组织中表达水平显著高于癌旁正常组织，并且生存分析结果显示FOXD2-AS1高表达组患者预后相对较差。细胞学实验结果表明，通过转染shRNA下调FOXD2-AS1的表达能够抑制CNE-1和SUNE-1细胞增殖；动物实验证实沉默FOXD2-AS1能够在体内抑制肿瘤生长并且免疫组化结果显示sh-FOXD2-AS1组Ki-67染色区域小于对照组。进一步研究发现，miR-363-5p与FOXD2-AS1存在结合位点，两者表达呈负相关，且miR-363-5p 能够抑制FOXD2-AS1 对肿瘤细胞增殖的促进作用；低表达的miR-363-5p失去对下游S100钙结合蛋白A1（S100 calcium binding protein A1，S100A1）负向调控作用，并且有研究证实异常高表达的S100A1与肿瘤的发生与侵袭转移高度相关［31］。

6.2 甲状腺癌Liu等［32］应用qRT-PCR对59例甲状腺癌组织及正常甲状腺组织进行检测后发现FOXD2-AS1 在肿瘤中表达水平显著上调；对TCGA数据库的分析结果表明复发性甲状腺癌组织中FOXD2-AS1 的表达水平更高。体外实验结果显示，沉默FOXD2-AS1 能够增加甲状腺癌细胞凋亡率并降低其存活能力；动物实验结果表明FOXD2-AS1沉默组肿瘤的重量和体积均小于对照组。进一步探究FOXD2-AS1 的下游靶点，对数据库进行分析并进行验证实验确定：FOXD2-AS1 能够作为ceRNA 吸附miR-7-5p 进而上调肿瘤细胞中端粒酶反转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）的表达水平来推动TC的发生发展。Zhang等［33］发现FOXD2-AS1与人激肽释放酶7（kallikrein related peptidase 7，KLK7）在甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中表达水平上调且高表达组患者预后相对较差。体外实验结果表明，敲低FOXD2-AS1 和KLK7的表达能够显著抑制肿瘤细胞迁移、降低细胞增殖能力并诱导凋亡发生。进一步的研究证实，失调控的FOXD2-AS1 通过ceRNA 机制吸附miR-485-5p进而上调KLK7表达来促进PTC的发生发展。

7 FOXD2-AS1与其他肿瘤

Ren等［34］通过分析TCGA数据库并进行定量检测后发现FOXD2-AS1在黑色素瘤中呈现异常高表达并且与患者的临床病理特征密切相关。CCK-8与Transwell 实验结果显示，利用si-FOXD2-AS1 转染A-375和SK-MEL-2细胞能够降低其增殖与侵袭迁移能力；Western blot实验证实外源性敲低FOXD2-AS1能够诱导Akt磷酸化水平降低。上述实验结果提示，FOXD2-AS1通过促进Akt磷酸化推动皮肤黑色素瘤的发生发展。张清等［35］研究发现FOXD2-AS1在卵巢癌中表达水平上调并且外源性下调FOXD2-AS1能够抑制肿瘤细胞增殖与迁移。进一步研究发现，FOXD2-AS1 通过miR-150-5p/GPR94调控轴激活Wnt/β-catenin信号通路，进而推动卵巢癌的恶性进展。

8 结 语

FOXD2-AS1 作为一个新发现的lncRNA，能够通过调控增殖、抗凋亡与侵袭迁移等恶性生物学行为来诱导肿瘤耐药并促进其发生发展。研究发现，FOXD2-AS1 具有十分丰富的调控机制，包括活化EZH2 和LSD1 对肿瘤细胞进行表观遗传学调控；激活NOTCH、TRIB3/Akt 和Wnt/β-catenin 信号通路促进肿瘤的恶性进展；作为“分子海绵”竞争性结合miRNA抑制靶基因的表达，但FOXD2-AS1调控上游和下游基因表达的精确分子机制仍有待系统研究。在临床应用方面，过表达的FOXD2-AS1与患者临床病理学特征及预后密切相关，这表明它可以作为肿瘤诊断和评估患者预后的潜在生物学标记物。总之，FOXD2-AS1 的研究刚刚起步，其相关功能、调控机制以及临床应用有待进一步的深入解析。