急性肝损伤模型及信号通路研究进展

岳淑雯，陈真

(中国药科大学药学院，江苏 南京 211198)

肝脏是人体内最大的实质性器官，它承载着包括物质的合成分解代谢、生物转化和内外分泌在内的多种功能，血液供应丰富，易受到体内外各种致病因素和刺激因子的侵袭，引起肝脏的炎症反应，进而产生损伤[1]。肝脏疾病作为临床上较为常见的疾病，一直是医学与药学重点研究的对象之一。

肝脏有一套在整体免疫系统中相对独立的特殊免疫系统，用以维持肝脏内部的免疫平衡[2]。在应对中等程度的炎症反应时，肝脏的固有免疫机制具备一定的保护作用，能够减少肝脏功能紊乱的发生；但当肝脏遭遇严重的炎症反应，并引起肝脏功能不协调时，就会导致急性肝损伤的发生。肝脏疾病的发生是一个极复杂的过程，其中包含了众多的细胞和炎性因子的参与，虽然目前关于肝脏损伤发生发展的过程的研究已有许多，但是其中确切的细胞和分子机制尚不是很清楚。肝脏炎症是许多急慢性肝脏疾病发展成肝实质损伤、肝纤维化、肝癌甚至肝衰竭的关键因素。

1 急性肝损伤模型的建立

为了更深入地了解肝脏疾病的发生发展机制，国内外研究者利用各种肝损伤动物模型来进行实验，相继建立了一系列用于模拟急性肝损伤的动物模型，包括有四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导的化学性肝损伤模型，刀豆球蛋白(concanavalin，Con)A、半乳糖胺(D-GalNactosamine，D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等诱导的免疫性肝损伤(immunological liver injury，ILI)模型；对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)诱导的药物性肝损伤模型；给予含乙醇饲料诱导的酒精性肝损伤模型等。研究发现，不同的肝损伤动物模型是由不同的发病机制介导的。

1.1 CCl4CCl4诱导的急性肝损伤模型是目前国际最常用的模型之一。CCl4作为一种亲肝的细胞毒性物质，能迅速被肝和脑吸收，目前对CCl4的肝脏毒性作用机制研究有很多，最得到公认的机制主要是自由基的形成及引发的链式过氧化反应。CCl4得到肝细胞的细胞色素P450的激活，生成自由基物质CCl3·和CCl3OO·，这些自由基会对膜结构上的多不饱和脂肪酸产生攻击，促使细胞膜、线粒体膜等生物膜发生脂质过氧化，从而导致脂质过氧化物的产生，后者反过来还能对各种生物膜造成进一步的损伤，使其稳定性和完整性降低、通透性增加，造成细胞内各种酶的溢出以及其他细胞损伤，最终导致肝细胞的凋亡与坏死。自由基除了可以引起生物膜脂质过氧化，还会与膜上脂质及蛋白质分子发生不可逆结合，对细胞膜和微粒体膜上钙泵的活性产生抑制，增加Ca2+内流，导致细胞内钙稳态的紊乱，最后引起肝细胞膜结构和功能的损伤，使细胞内转氨酶溢出进入血液，从而造成血清中ALT、AST含量的异常升高。血清中各种转氨酶活性高低是判定肝细胞受损伤程度的重要指标，临床上用于反映肝细胞的损伤程度。

1.2 D-GalN/LPS 腹腔注射LPS以及D-GalN是构建小鼠急性肝损伤模型的较为便捷的方法。LPS是革兰阴性菌细胞壁表面的成分，据报道它可以引发内毒素损伤，可通过刺激包括巨噬细胞在内的免疫细胞释放炎症因子，从而使肝细胞发生凋亡与坏死[3]。在D-GalN诱导的肝脏毒性模型中，对mRNA合成的抑制和对糖复合物的转移后修饰的部分抑制是关键步骤。继发损伤中，巨噬细胞和粒细胞被激活，炎症反应进一步发展为肝细胞凋亡。毒性剂量的D-GalN是通过耗竭三磷腺苷、抑制大分子合成导致肝细胞坏死的。另外，也有研究认为D-GalN通过包括脂质过氧化物在内的氧化应激调节因子来介导氧化应激的产生。有报道称包含自由基的反应在D-GalN介导的坏死中有重要的作用。有研究证明，降低线粒体DNA的表达水平会导致线粒体呼吸链酶复合体和ATP合酶的活性下降，从而导致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，ROS在多种肝损伤模型中都是造成损伤的主要物质[4]。在LPS和D-GalN的协同作用下，实验动物的肝细胞在短时间内大量死亡，肝脏生理功能严重受损。

1.3 对乙酰氨基酚 对乙酰氨基酚是世界范围内广泛使用的解热镇痛抗炎药，它在治疗剂量下的合理使用是相对安全的，但是高剂量的APAP会导致肝脏毒性，这使得APAP成为急性肝损伤的主要致病原因之一[5]。在美国，每年约56 000人因过量服用APAP所致肝损伤就诊于急诊室，2 600人住院治疗，500人死亡。我国目前也有过量服用APAP致死的病例报道，APAP诱导的急性肝损伤已然成为严重的公共卫生问题。

正常情况下，APAP会被葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGTs)或硫酸转移酶(sulfotransferases，SULTs)催化成无毒代谢物。过量的APAP会使机体的醛糖酸化反应通路和硫酸盐化反应通路饱和，多余的APAP在细胞色素P450酶系统的作用下生成具有高毒性的活性中间物N-乙酰-P-苯并醌亚胺(n-acetyl-p-benzoquinone-imine，NAPQI)。正常情况下NAPQI会被谷胱甘肽(glutathione，GSH)解毒，进而被多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)转移进入尿液。然而大量堆积的NAPQI会耗竭GSH，导致氧化应激最终引发肝细胞损伤[6]。

1.4 酒精性肝损伤 酒精摄入过量，无论是长期性还是一次性，都是重要的社会、经济和临床问题，它已成为世界排名第五的可预防性致病致死原因。酒精摄入过量是世界范围内多脏器病变的致病因素，这其中就包括酒精性肝病。酒精性肝病是一系列临床疾病，包括脂肪肝(steatosis)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，甚至有可能进一步发展为更严重的疾病如肝纤维化和肝癌。乙醇主要在肝脏代谢，被氧化为乙醛后与肝细胞胞质内乙醇脱氢酶作用并产生大量H+，导致异常的氧化应激反应，并且影响脂肪代谢，促进α-磷酸甘油合成甘油三酯，最终导致肝脏的脂肪堆积；另有少部分经肝细胞微粒系统催化产生大量自由基，导致肝细胞损害。同时，乙醇可增加肠道通透性及促进内毒素从肠道进入门静脉系统，诱导内毒素血症，刺激库普费细胞(kuffer cells，KC)产生大量细胞因子，导致肝脏炎性损伤[7]。

2 通路研究进展

2.1 Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)-核因子E2相关蛋白2(Nrf2) Nrf2被认为是应对氧化应激最主要的调节因子之一，Keap1-Nrf2通路在氧化应激和外源性物质应激中都扮演着重要的保护作用。Nrf2(NF-E2 related factor 2)是bZip(basic region-leucine zipper)类转录因子，它属于Cap′n′collar(CNC)家族。Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)是Cullin3为基底的泛素E3连接酶调节蛋白，它在非应激状态下会抑制Nrf2的活性。在非应激条件下，Keap1与Nrf2连接停留在细胞质中，并促进Nrf2的泛素化；Nrf2不断地被蛋白酶体降解[8]；Keap1可以对多种刺激产生反应，其中包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、活性一氧化氮(reactive nitrogen oxide species，RNOS)和总金属。当受到刺激时，Keap1-Cul3复合体的泛素E3连接酶活性下降，Keap1失去活性，从而使得Nrf2稳定存在。失活的Keap1不会和Nrf2解偶联，因此从头合成的Nrf2进入细胞核内。Small Maf蛋白包括MafG、MafK和MafF，它们属于Maf转录因子家族，该蛋白可以和CNC转录因子家族的成员，如NF-E2 p45、Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1和Bach2，形成异二聚体。Nrf2和其他的CNC蛋白不能直接与DNA发生结合，所以需要与Small Maf形成异源二聚体共同参与到转录调节中。因此，缺乏Small Maf蛋白会减弱Nrf2的激活。Nrf2与Small Maf蛋白组成的异源二聚体激活相关基因的转录，其中包括解毒酶相关基因和抗氧化相关基因，从而起到该通路的抗氧化活性。该二聚体首先和相关的顺式调节元件结合，这些和编码解毒酶相关基因的激活相关的顺式调节元件被称为抗氧化反应原件(antioxidant response element，ARE)[9]。

Nrf2作为重要的转录调节因子，可以通过与ARE结合上调多种酶的含量，包括MRPs、谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferases，GSTs)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(Nicotinamide quinone oxidoreductase1，NQO1)和血红素氧化酶(hemeoxygenase，HO-1)，从而产生细胞保护作用，有效应对氧化应激[10]。HO-1是一种关键的保护酶，它可以对炎症导致的脏器损伤产生保护作用。许多实验表明，抑制HO-1会造成炎症调节因子表达明显增加，反之，增强HO-1的酶活性能降低这些因子的表达。同时也有实验表明，HO-1对LPS造成的脏器损伤也有保护作用[11]。

Ramos-Tovar等[12]的实验证明，Nrf2作为内源性的细胞保护系统可以激活抗氧化酶的表达，降低活性代谢物的水平；CCl4造成的小鼠急性肝损伤中，Nrf2的表达水平下降。Liu等[13]的实验证明，在ConA诱导的急性肝损伤模型中，相较于野生型小鼠，Nrf2敲除的小鼠损伤更严重；给予Nrf2的激活剂CDDO-Im，相较于Nrf2敲除的小鼠，特异性敲除肝脏中Keap1的小鼠和野生型小鼠损伤明显减少。González-Rodríguez等[14]的实验用针对Keap1的小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)来研究Nrf2在急性肝损伤中的作用：小鼠尾静脉分别注射包含Keap1- siRNA和空白siRNA的脂质体，48 h后用ConA诱导急性肝损伤模型，结果显示，沉默肝脏中的Keap1，从而激活Nrf2，可以减轻ConA诱导的炎症相关肝脏损伤。

2.2 TLR4 通过Toll样受体4(Toll-Like receptor-4，TLR4)引起固有免疫系统的激活是多种病原学导致的肝脏炎性疾病的关键环节，例如酒精性脂肪肝炎(alcoholic steatohepatitis，ASH)、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、药物氧化毒性、肝脏免疫疾病和肝移植排斥反应。TLRs是一类模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)。PRRs起初被认为是与对微生物攻击的反应有关，它通过感受/探测特殊的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，例如脂多糖、微生物多肽，蛋白质(胞壁二酰肽，鞭毛蛋白)和双链核糖核酸(double-stranded ribonucleic acids，dsRNA)，并触发一系列的免疫反应。近年来发现，PRRs不仅可以识别微生物信号，还可以识别机体内部的“危险”信号(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，包括代谢紊乱引起的饱和脂肪酸、磷脂质、胆固醇结晶、尿酸钠结晶、淀粉样β蛋白和细胞外ATP[9]。

TLR4在肝脏所有细胞中都有表达，但是在肝巨噬细胞上表达量最多。配体与TLR4的结合会激活一系列细胞内信号通路，这种激活作用可以通过两条不同的信号转导通路产生： MyD88(myeloid differentiation primary responsegene 88)依赖途径和TRAM-TRIF依赖途径。TLR4通过上述两条通路引起核转录因子的表达，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路、核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和激活蛋白-1(activation protein-1，AP-1)。上述信号通路会进一步激活特定基因的转录，上调炎症因子的表达，包括TNF-α、IL-6和IL-1b等，导致炎症的产生。

Ning等[15]的实验表明，D-GalN/LPS导致的急性肝损伤模型能增加TLR4的表达，并提高TNF-α、IL-1β和IL-6的转录；将TLR4的阻断剂TAK-242能够减少上述炎症因子的表达。Tang等[16]的实验表明，酒精介导的小鼠急性肝损伤中，肝脏中TLR4及其下游的NF-κB的表达量显著上升。Jia等[17]的实验证明，酒精造成的急性肝损伤模型中，小鼠特异性敲除肝细胞TLR4可以减少肝脏损伤。

2.3 NLRP3 人类胞质中的NLRs家族已知有22个成员，分为5个亚家族：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX。所有成员均包含一个NACHT结构域，这个结构域与低聚反应(oligomerization)相关，另有一个C端亮氨酸富集重复结构域，这个结构域参与PAMPs和DAMPs的感知。NLR不同亚家族靠N端效应器结构域区分，该结构域赋予各NLRs不同的特性。NLRP亚家族的成员包含一个热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)，功能是把NLR受体分子和下游衔接蛋白及效应分子连接起来，它的主要功能是组合多蛋白炎症复合体，也称为炎症复合体，以此对应激信号产生反应。其中，NLRP3炎症复合体是研究比较透彻的。被PAMPs和DAMPs激活后，NLRP3通过募集凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)形成NLRP3炎症复合体，这个复合体包含一个N端的PYD，一个C端的胱天蛋白募集域蛋白(caspase activation and recruitment domain，CARD)，和一个caspase-1酶原，它是激活caspase-1的先决条件。随后，被激活的caspase-1将IL-1β和IL-18切割成活性形式，因此导致细胞的程序性死亡[18]。

细胞质中形成NLPR3炎症复合体(复合体包括NLRP3、caspase-1和ASC)需要两个步骤：①第一步，第一信号通过TLR-NF-κB使炎症复合体各组分转录增多，包括NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18。这一步是必需的，因为NLRP3在静息的细胞中的基础表达量不足以有效激活炎症复合体。②第二信号(ATP、草酸结晶等)使NLRPs产生同源低聚，组成活化状态的复合体，该复合体可以将前体物质转化为具有生物活性的IL-1β和IL-18[9]。因此，抑制NLRP3炎症小体的活化可能是控制炎症反应在合理范围的良好策略。

Pourcet等[19]通过实验发现，腹膜巨噬细胞中NLRP3的调节需要NR1D1，人或小鼠敲除NR1D1的原代巨噬细胞中NLRP3的表达发生改变，IL-1β和IL-18的表达也会发生改变；将巨噬细胞和NR1D1的激活剂SR9009共培养可以减少NLRP3的表达和细胞因子的分泌，给予NLRP3的抑制剂MCC950可以减轻D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤。Gehrke等[20]的实验证明，相较于野生型小鼠，敲除肝脏IL-1R1的小鼠在给予D-GalN/LPS后4 h肝脏中NLRP3和caspase-1的转录明显减少，实验表明，肝细胞中IL-1R1的表达减少会影响NLRP3通路，减少细胞凋亡，减少可能导致肝脏炎症的炎症调节因子的释放。

3 总结

急性肝损伤是许多肝脏疾病的起始状态，探究其发生的机制，是药物研发的关键。目前认为，急性肝损伤的发病机制与氧化应激和炎症有着密切的关系。Nrf2是氧化应激的重要调节因子之一，这也是其成为应对急性肝损伤可能的通路之一。静息状态下，Keap1与Nrf2结合，使后者泛素化从而停留在细胞质中；受到刺激后，Nrf2进入细胞核，促进解毒和抗氧化相关基因的表达，对急性肝损伤产生保护作用。TLR4是一类模式识别受体，可以对体内外产生的多种危险因素发生响应，该通路激活后会导致炎症细胞分泌炎症因子，破坏肝脏稳态。NLRP3被激活后会形成炎症复合体，产生具有活性的caspase-1，后者将IL-1β和IL-18的前体切割成有活性的形式，从而导致细胞程序性死亡。上述3条通路都为解释急性肝损伤的产生提供了思路，也是研发治疗药物的可能靶点。