创伤性脑损伤动物模型的研究进展

周建国综述，唐华民审校

0 引 言

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是一种由外力引发的颅内损伤，这种外力可来自于打击、撞击、子弹、甚至是爆炸［1］。TBI主要导致神经细胞坏死，引起继发性损伤级联反应，包括：兴奋性中毒、氧化应激、线粒体功能障碍、血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）破坏和神经炎症［1-3］。为了进一步研究TBI的病理生理机制及其治疗措施，从20世纪80年代开始先后研发了很多种类的TBI动物模型，目前有以下几种模型被广泛应用于实验研究：即重物坠落损伤模型（weight-drop injury models，WDI），液压冲击损伤模型（fluid percussion injury models，FPI），控制性皮质损伤模型（controlled cortical impact injury models，CCI），穿透弹道式脑损伤模型性（penetrating ballistic-like brain injury models，PBBI），爆炸伤模型（blast injury models，bTBI）等。本文将对这5种模型的造模原理和特点作一综述。

1 WDI模型

大多数WDI模型的基础是将轻度麻醉的动物暴露颅骨（有或没有开颅手术）后，通过自由落体的重物引起损伤。TBI的严重程度可以通过调整重物的重量或释放的高度来控制，损伤的性质和神经功能缺损取决于受伤部位（中央或外侧）和生物力学。最常用的WDI模型是Fenney等［4］的局灶性损伤，Marmarou等［5］的弥漫性损伤和 Shohami等［6］的混合性局灶/弥漫性损伤。

1.1 Fenney模型在Fenney的重物坠落模型中，通过开颅手术，将重量传递至完整的硬脑膜引起皮质损伤［4，7］。从形态学上看，这些损伤是由损伤后头几个小时内直接在挫伤皮层处发生的白质出血以及24h坏死腔的发展而引起的［4］。然而，这种损伤模型近年来已经不受欢迎，可能是因为需要开颅手术。

1.2Marmarou模型Marmarou的冲击加速度WDI模型用于诱导弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）模型，模拟人类跌倒或机动车事故引起的弥漫性 TBI［5］。在 Marmarou 模型中，将麻醉动物作头皮中线切口以暴露颅骨，然后将其头部固定在金属盘上，以防止颅骨骨折；置大鼠于泡沫床，将黄铜的重量落到金属盘上使大鼠头部受到撞击［5］。动物死亡的原因主要是因为闭合性头部损伤（closed head injury，CHI）引起的呼吸抑制，继而出现了低血压等症状。该模型能够在啮齿类动物中产生分级脑损伤，而不会产生大幅度的高血压波动或过度的脑干损伤［5］。单次和重复性mTBI均可引起视神经/管、小脑、皮质脊髓束、外侧淋巴结和胼胝体的创伤性轴索损伤［8］。在显微镜下，该模型产生大脑神经元、轴突和微脉管系统的分级广泛损伤，还可导致大量DAI，主要涉及胼胝体、内囊、视神经、大脑脚和脑干等［9］。Ezaki等［10］使用Marmarou模型，提出外周撞击力不能诱导TBI小鼠中海马的CA1区、CA3区神经元变性；此外，除了外周撞击力或头皮切口以外的因素也可能引起海马CA1区和CA3区神经元变性。Buchele等［11］介绍了一种新型闭合性弥漫性TBI大鼠模型，它可能更接近地模仿人类额叶损伤机制，出现创伤后慢性认知缺陷以及DAI。

1.3Shohami模型Shohami等［6］研究小组介绍了一种用于CHI的啮齿动物模型，被广泛用于诱导混合性局灶/弥漫性损伤。使用标准化的WDI装置在未受保护的颅骨上诱发损伤，可导致神经损伤和BBB功能破坏。Shultz等［12］研究证实损伤后会出现神经炎症、水肿和BBB破坏。产生CHI后对小鼠进行神经功能损伤程度评分（neurological severity scores，NSS）的最佳时间为1h［13］。进行NSS评估可以了解动物的运动功能、警觉性和寻求行为的神经功能障碍。动物的神经损伤严重程度与脑损伤的严重程度高度相关。WDI模型装置简单，易于操作，实验可控，能够复制分级脑损伤，成本较低，因此得到普遍应用。但是动物脑损伤死亡率较高，稳定性、重复性较差。

2 FPI模型

FPI模型率先由Dixon等［14］于1987年建立，操作过程是将麻醉的动物置于立体定位框中，切开头皮，在前囟和人字缝的中间、矢状缝上方钻出直径为4.8 mm的孔，通过钟摆撞击液体储存器活塞，对骨窗施加液体压力脉冲，撞击造成脑组织的短暂位移、变形，从而导致弥漫性脑损伤，损伤的严重程度取决于压力脉冲的强度［15］。根据开颅手术距离矢状缝的位置，可将FPI模型分为中线（以矢状缝为中心），矢状缝旁（距离中线＜3.5mm）和侧方液压模型（距离中线＞3.5mm）。LFPI模型是目前使用最广泛的TBI动物模型之一，主要用于啮齿动物［16］。Reid等［17］用LFPI模型研究创伤后癫痫（Posttraumatic epilepsy，PTE），结果显示FPI导致早期带尖峰高频震荡和来自周围的新皮质引起自发性局灶性癫痫发作，癫痫的严重程度随着时间的推移而增加，并与损伤严重程度有关，说明了LFPI可用作PTE模型。Wahab等［18］建立了一个音圈驱动液压损伤装置，该装置的特点：①可重复性出现液压冲击损伤，能够控制损伤的速度和程度；②产生的损伤结果与常用的钟摆式FPI系统一致，具有与不同损伤程度和持续时间相关的病理生理学的研究能力；③FPI的死亡率与损伤的上升时间密切相关。Hameed等［19］建立了快速侧方液压模型（rapid lateral fluid percussion Injury，rLFPI），该模型能快速、可重复的造出癫痫性损伤模型，并能够缩短手术和麻醉时间；rLFPI模型可导致外伤性癫痫发作和区域性胶质细胞增生，局限于脑皮质的细胞凋亡和健侧脑室扩大的慢性病理变化。

FPI模型可以精确控制致伤部位和打击方向，并输出精准的冲击压力，应用范围较广。但骨窗处需要用骨水泥连接打击帽，每次打击前均需矫正，造模效率较低，且器材昂贵。此外，与其他动物模型相比，具有较高的死亡率，这可能是由于脑干损伤时间延长导致呼吸骤停。

3 CCI模型

CCI，有时是指皮质挫伤，是一种使用受控的气动或电磁装置［20-23］，将冲击器驱动至暴露的完整硬脑膜上，直接诱导皮质损伤。CCI模型最先是由Lighthall等［20］建立，该设备由加压气体（即气动驱动）驱动，目前气动CCI仍然广泛用于研究TBI病理生理学和测试新疗法［21-22］。与气动CCI装置一样，电磁CCI装置选择传统的与商用立体框架结合使用，便于调节冲击角度；有些设备还与可以提升伤害装置，与关节支撑臂兼容，以便于在猪和其他大型动物中建立CCI模型。目前很少有研究证据比较气动和电磁模型；然而，一项研究表明，与气动CCI相比，电磁CCI具有更高的可重复性［23］。

CCI模型被称为最精准的模型之一，迅速地成为临床前TBI最常用的模型之一。其最常用于实验室大鼠及小鼠上，也可适用于大型动物上，如猪和非人灵长类动物。操作过程是将麻醉动物置于立体定位框架中，在前囟和人字缝之间选择预定的坐标进行单侧开颅手术，然后通过气动或电磁装置以给定的速度将驱动刚性撞击头至给定的深度，冲击完整的硬脑膜，造成皮质损伤。这种模型的优势在于可以调整CCI操作中的参数，例如：深度、速度、冲击或停顿时间，冲击器尖端的大小［24］。由于可以调整许多参数，因此可以通过多种方式来实现更轻度的CCI模型，比如：减小冲击深度，降低冲击速度，减小尖端的大小［24］。电磁CCI研究发现，保持尖端大小、停顿时间和速度（分别是3.5 mm，0.1 s，5.25 m/s）恒定，随着冲击深度（分别是1.5、2.0、2.5 mm）、损伤的程度逐渐增加，认知功能障碍逐渐增加，但是没有情绪障碍［25］。有文献表明，TBI患者的执行功能障碍与脑损伤严重程度直接相关［26］。已知CCI后的大体组织学变化包括：皮质挫伤，血脑屏障破坏，海马细胞损失和总体脑容量丢失，还会导致灰/白质萎缩、慢性脑室扩大、细胞凋亡、坏死、轴突损伤和炎症。CCI模型的功能缺陷体现在多方面，包括整体神经功能、记忆、学习、运动功能和额叶功能。CCI模型还可以用于PTE的研究［27］。有研究报道，使用CCI诱导TBI模型在一年后出现了一些病理生理学改变，包括慢性小胶质细胞活化，病变体积扩大、海马神经元变性、脑室扩大、髓鞘丢失和胆碱能神经元代偿反应［28-29］。

CCI模型有几个显著的优势：①可以高度控制损伤参数，造模稳定；②具有临床相关性，可产生类似于人类TBI方面的形态学和脑血管损伤反应；③可用于模拟整个寿命期间的损伤。尽管CCI可以操控损伤参数以用来控制伤害严重程度，但在实验室中对于轻度、中度或严重的损伤没有标准化。此外，该装置价格比较昂贵，需要经常维护，实验精度要求较高。

4 PBBI模型

PBBI是一种穿透性创伤性脑损伤大鼠模型，通常是由于高能量弹头和冲击波造成，在脑部形成一个暂时的空洞，空洞体积是弹头本身大小的许多倍［30］。脑组织损伤和临床表现主要取决于解剖路径和能量传递的程度［31］。PBBI从脑出血状态（0～6h）发展为核心区域的细胞坏死，嗜中性粒细胞（24h）和巨噬细胞（72h）浸润，远离核心病灶区域的神经元和纤维束（丘脑，内外囊和大脑脚）退化［32］。PBBI后，IL-1β、IL-18、半胱天冬酶-1（caspase-1）、半胱氨酸蛋白酶激活区凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、X-连锁凋亡抑制蛋白和NOD样受体蛋白3的表达在48h左右达到高峰；来自PTBI动物的脑蛋白裂解物显示通过ASC梯度证明了巨噬细胞形成，在损伤后48h还有gasdermin-D的持续表达；ASC在活化的小胶质细胞中表达持续到伤后12周［33］。PBBI亦可出现BBB［34］，继而引起神经元和星形胶质细胞的突然中断和快速破坏，导致血液中早期生物标志物出现［35］。经PBBI诱导后的大鼠，联合低氧血症和失血性休克会进一步降低丙酮酸水平，增加乳酸/丙酮酸比例，加剧创伤后代谢紊乱［36］。可以使用Morris水迷宫来评估PBBI大鼠模型认知缺陷［37］。PBBI可以诱发产生灰/白质损伤，脑肿胀，癫痫发作，神经炎症，认知障碍［38-39］。现今，包括抗癫痫药物、神经生长因子和人类神经干细胞移植在内的治疗性研究已经得到相应评估［38-40］。

PBBI的几种病理生理学特征与其他TBI模型相似，但由于损失的穿透性及形成的暂时性空腔，其在原发病灶中会引起广泛的颅内出血［7］。

5 bTBI模型

bTBI在作战军人的头部受伤中比较常见。由于伊拉克和阿富汗战争，美国武装部队头部受伤的情况一直在上升。在伊拉克自由行动中的一个作战地点研究表明，有78%受伤是由简易爆炸装置引起［41］。越靠近爆炸地点，伤势往往越重。值得注意的是，即使是较小的bTBI也会产生长期或迟发性认知、神经精神症状［42］。为了有助于更好地理解bTBI以降低军人的发病率、死亡率，许多bTBI实验室正在模拟类似于爆炸物产生的爆炸波。即将动物置于激波管中，并暴露于由气压或爆炸引起的爆炸波中。爆炸波会损害大脑血管、神经元、神经胶质细胞、BBB破坏，以及小胶质细胞激活和神经炎症［43］。和其他损伤模型一样，bTBI也会出现脑室扩大、灰/白质萎缩、轴突损伤、细胞凋亡、神经炎症等病理结果［43-44］。冲击波引起的脑损伤机制目前尚不清楚，但有研究者认为：①冲击波引起声阻抗失谐，导致脑组织中的冲击泡沫效应；②爆炸可能导致体腔内压力增加，诱发血液涌入大脑产生大脑功能障碍［45］；③ 线粒体功能障碍［46］。Ning等［47］发现咖啡因在bTBI后不同阶段可以对兴奋性中毒、炎症、星形胶质细胞增生和神经元损失起神经保护作用，长期服用咖啡因可改善记忆功能障碍。此外，腺苷A1受体表达上调可能对慢性咖啡因消耗起到有利影响，可以为针对bTBI的腺苷受体的靶向治疗提供可行性策略［47］。BCI-838（第II组代谢型谷氨酸受体拮抗剂前药）可用于逆转bTBI大鼠模型中的创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）相关特征，改善焦虑、恐惧和长期识别记忆［48］。

随着bTBI研究的发展，研究应特别注意以下几个方面：①bTBI发病率高，会产生长期的后遗症和PTSD，影响军人的作战能力；②需要开发便携式人员保护装备，尽可能减少伤员的长期认知功能障碍；③bTBI机制涉及多学科，需加强力学、数学、计算机专家的合作，以获得“全新”突破；④体内成像技术，高分辨率成像技术等先进技术的应用将有助于深入阐明爆炸伤害并提出系统的解决方案［49］。

总的来说，与实验性TBI的急性效应相比，慢性效应仍然表现不佳。虽然TBI动物模型复制了临床上观察到的大部分组织病理学和功能结果，但现有的动物模型不能完全复制人类TBI，研究人员在使用实验性TBI模型时需要谨慎考虑，以确保选择最合适的模型来解决研究问题。