基于疾病微环境靶向的精准纳米靶向技术研究

田 泾，高 申

0 引 言

国际领域的精准医疗的建立与发展，源自美国医学界2011年首次提出的“精准医学”概念［1］，即基于患者的基因和生理来定制治疗方案［2］。近几年，我国针对精准医疗领域的政策也非常密集，针对精准医疗，国家指南中提出了“队列、大数据、生物标记物、精准预防、精准治疗”等重点研究方向。主要包括基因测序技术和靶向治疗技术，其中基因测序技术主要应用在临床医疗、肿瘤诊断以及基础研究上。靶向治疗主要包括分子靶向药物（单抗药物、激酶抑制剂等）、载体靶向药物治疗、细胞免疫治疗、干细胞治疗等。纳米技术作为21世纪的关键技术之一，由于其覆盖面广、跨学科等特点推动了各个研究领域的迅猛发展，在精准医疗研究领域也得到了广泛的应用［3］。本文就近几年来纳米医学领域专家针对肿瘤、AS等疾病微环境特点设计的纳米靶向制剂的相关研究进行阐述，以期为精准纳米靶向制剂的研究和设计提供参考。

1 精准纳米靶向给药载体的现状及挑战

纳米材料有其独特的的电学、力学、光学、磁学等特殊性能，使得其在生物医学领域的应用越来越广泛，特别是在疾病的诊断和治疗上的应用也越来越受到重视。由于各种疾病本身的复杂性，若想实现诊断或者治疗，必须使得纳米材料与治疗药物、生物大分子、等联合使用，这就衍生出了功能化的纳米载药系统。由于不同疾病的病灶特征不同，精准靶向还需要考虑病灶部位的微环境，因而各种智能、自驱动纳米载药系统应运而生，在病灶部位实现pH敏感、光电敏感“开-关”等设计［4］。为了解决纳米载体的免疫清除以及自主靶向问题，仿生纳米医学和DNA纳米机器人技术也应运而生［5-6］。随着分子生物学和纳米医学的发展，针对不同疾病的研究越来越透彻，基因治疗、化学治疗、免疫治疗等治疗手段结合纳米技术的应用也越来越广泛，使得针对不同疾病的治疗逐渐趋于精准化，这些都离不开纳米载体的更新换代的发展。

精准给药技术的应用，有赖于精准载药系统的设计。理想的药物递送系统进入体内，需要克服不同的困难和挑战。例如在设计肿瘤治疗的基因药物递送系统时，需要考虑两大方面的问题。一是给药系统在血循环中需要克服的屏障，二是需要考虑给药系统到达靶细胞部位时，如何克服细胞屏障。例如针对糖尿病治疗基于纳米技术的口服糖尿病肽产品的设计，就需要考虑载体如何克服肠道屏障［7］；对于不同疾病，由于发病机制不同会形成不同的病灶微环境，那么针对不同病灶微环境去设计微环境敏感的给药系统或者针对在靶部位施以磁场、超声、光、辐射等外部影响因素来触发的给药系统，增强靶部位药效，减轻系统性毒性，是目前实现不同疾病精准给药的主要策略［8］。

2 抗肿瘤治疗纳米载药系统

2.1肿瘤细胞及其微环境特点肿瘤微环境，顾名思义是指肿瘤细胞赖以生存的复杂环境，主要是由癌细胞和多种基质细胞细胞因子、趋化因子等组成［9-。下面从肿瘤细胞和肿瘤细胞生长的环境介绍肿瘤微环境的特点。肿瘤细胞通常会特异性表达多种受体和生物标记，例如许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高表达叶酸受体，具有组织特异性［10］。肿瘤细胞也常常伴随着大量的基因的变异与表达，使得肿瘤细胞处于氧化应激的状态，而产生大量的活性氧，如H2O2，NO等［11］。另外由于肿瘤细胞内外氧化还原环境平衡的打破使得肿瘤细胞内的GSH至少是正常细胞胞内的4倍［12］，形成肿瘤细胞内微环境的高还原性的微环境特点。能量来源于糖酵解途径的肿瘤细胞也会生成大量乳酸，使得肿瘤组织周围呈微酸性［13］。另外肿瘤组织处于高代谢状态，能量需求增加及肿瘤体积的高度膨胀导致血供不足，最终也导致了肿瘤组织的乏氧的微环境特点［14］。

由于肿瘤细胞无限增殖使得血管快速无序增殖，形成了大量血管壁间隙较大，结构完整性差，缺乏淋巴回流的血管，使得大分子物质和脂质具有选择性的高渗透性和滞留性，这种现象简称为实体瘤组织的高渗透强滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）效应［15］。大多数肿瘤，例如上皮来源的肿瘤组织及其周围的基质内，都存在吞噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞，这些炎症细胞及其所分泌的炎症因子构成了肿瘤生长的环境，除了有一定的抗肿瘤作用，更多的是促进肿瘤的发生发展［16］。其中对肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）的研究最为深入，TAMs可以通过分泌肝细胞生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子等多种可以促进肿瘤生长的生长因子［17］，另外TAMs可以分泌趋化因子配体18和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9，以及纤溶酶、组织蛋白酶等降解胶原等细胞外基质成分，进而破坏基底膜、引发癌细胞发生转移［18］。近几年来，随着分子生物学和肿瘤细胞生物学的发展，使得肿瘤与肿瘤微环境之间的相互作用研究的越来越深入，这不仅为肿瘤的诊断、预防有着重要的作用，也将针对肿瘤微环境的精准治疗提供依据。

2.2基于肿瘤微环境的精准纳米靶向给药系统设计基于肿瘤微环境与正常生理微环境的差异，可以设计靶向肿瘤微环境的载药系统，例如可以根据肿瘤部位脉管系统的EPR效应，可以将纳米载体的尺寸控制在200 nm以下，使得纳米载体被动靶向至肿瘤部位。另外可以根据肿瘤微环境的微酸、低氧、高浓度谷胱甘肽，免疫炎症等特点设计相应的肿瘤微环境敏感或靶向的载药系统。

2.2.1基于谷胱甘肽微环境敏感释放的纳米载药系统多肽分子由于结构简单，种类繁多，易于合成，毒性较低，是作为纳米载体的理想构建单元［19］。我们调研文献发现［20］，具有穿透细胞膜能力的阳离子细胞穿膜肽多肽可以较好的递送基因药物进入细胞，且毒性较低。通过利用半胱氨酸交联或者硫辛酸修饰都可以形成对细胞内高浓度谷胱甘肽敏感释药的二硫键的特点，以及穿膜肽对负电性的基因药物的压缩，构建半胱氨酸桥连或者硫辛酸修饰的细胞穿膜肽，自组装构建载药的肿瘤细胞谷胱甘肽敏感释放纳米粒，进而实现抗肿瘤综合治疗［21-22］。

2.2.2基于肿瘤微环境主动靶向的仿生纳米载药系统基于低免疫原性、靶向性、安全性的宗旨，利用细胞膜（巨噬细胞膜，红细胞膜等）进行伪装包裹以及利用细胞外囊泡中外泌体等内源性仿生纳米载体进行载药也逐渐成为趋势［23-24］。外泌体是由细胞分泌到细胞外的一种直径约30～120 nm的膜性囊泡。由于外泌体由细胞产生，具有天生的运输作用，作为纳米药物载体有独特的优势［25］，表现在：内源性载体，不会引起有害的免疫反应；稳定性好；组织穿透力强，向组织转运药物的效率高。我们课题组利用结肠癌细胞表面高表达A33抗原这个特点，通过收集结肠癌细胞分泌的带有A33表面抗原的外泌体，利用Fe3O4磁性纳米粒对外泌体进行A33抗体的修饰，构建靶向结肠癌细胞的给药系统。体外细胞实验和体内活成成像实验均表明了良好的靶向性。体内药效实验其抑瘤率达91.01%，生存期长达61 d，体内安全性也显示了抗体修饰的外泌体可以明显减轻阿霉素的心脏毒性以及抑制肿瘤组织细胞的皱缩和凋亡［26］。根据肿瘤炎症的微环境特点，我们设计采用可以避免免疫识别、同时具有炎症趋向的巨噬细胞作为载体，首先利用具有光敏特性和高载药量的还原氧化石墨烯（reduced Graphene Oxide，rGO），构建一个光敏性载多柔比星的纳米递药系统。再采用巨噬细胞吞噬改纳米载药系统（Dox-rGO/MAs），得到具有光敏特性的仿生纳米递药系统。初步研究表明，通过尾静脉注射携载石墨烯/阿霉素的巨噬细胞（MAs-DOX/rGO），给药8 h后，分别在肿瘤部位给予近红外光照射5 min（1 W/cm2），PBS对照组中肿瘤部位的温度略微升高至32℃，而MAs-DOX/rGO组肿瘤部位的温度升高至46.7℃，体内抑瘤效果也比较显著。

2.2.3基于免疫检查抑制点的仿生纳米载药系统目前肿瘤免疫治疗主要包括免疫疫苗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等，其中免疫检查点抑制剂治疗以其显著的临床疗效而备受瞩目。通过抑制免疫检查点活性，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应，发挥抗肿瘤作用。T细胞的完全活化依靠“双信号”系统调控：第一信号为T细胞对抗原识别；第二信号来自协同刺激分子。如CD28/B7是重要的正性共刺激分子［27］。有研究表明，PD-1与PD-L1结合可导致PD-1细胞质结构域中的两种酪氨酸（Y224和Y248）磷酸化，使得PD-1本身以及CD28去磷酸化，进而可终止CD28信号传递。研究提示肿瘤免疫治疗中，在阻断PD-1/PD-L1免疫抑制途径的同时还需重新恢复CD28信号传递。根据这一提示，有研究者设计了可同时作用于PD-1和CD28的双靶向免疫载药系统［28］。也可以通过构建表达有链霉亲和素的外泌体，利用亲和素-生物素反应，修饰上生物素化的PD-L1和CD28抗体，，进而实现阻断PD-1/PD-L1免疫抑制途径的同时重新恢复CD28信号传递，从而增强抗肿瘤作用。

3 抗AS治疗纳米载药系统

3.1 AS的病灶微环境AS是一种进展缓慢的慢性炎症过程，内皮损伤也是AS发生的关键病理生理因素［29］。与实体瘤局部存在的EPR效应特征相似，伴随有血管通透性的增加，这一病理特征是纳米递送系统被动靶向至AS斑块部位的前提和基础［30］。AS的微环境与AS的进展过程密切相关。脂质浸润学说发病机制主要包括下面3个过程：①动脉内皮下脂质颗粒的蓄积和修饰；②单核细胞的黏附与迁移；③巨噬细胞吞噬，泡沫细胞形成。上述每一环节上都可以作为精准给药的靶点。例如内皮细胞上表达的血管细胞黏附分子-1、整合素（Integrin）、胶原等，都可以作为靶点设计药物治疗和影像诊断的靶向给药系统。

3.2基于AS微环境的精准纳米靶向给药系统设计Cui等［31］采用在衣壳蛋白VP1上修饰靶向巨噬细胞的靶向肽和凝血酶抑制剂水蛭素，然后自组装形成包载近红外量子点形成多功能的病毒样纳米粒，在靶向巨噬细胞的同时实现水蛭素的递送和近红外量子点的成像，构建了诊疗一体化的精准纳米给药系统。Gao等［32］通过骨桥蛋白抗体修饰上转换纳米粒来识别巨噬细胞和泡沫细胞所分泌的标志物骨桥蛋白，实现不稳定期的动脉粥样斑块的靶向成像。这些纳米药物递送载体都巧妙地根据AS疾病发展过程中的微环境特点进行靶向修饰，实现AS疾病精准靶向诊疗。

4 抗菌消炎纳米载药系统

4.1炎症病灶的微环境炎症主要的微环境特点是形成了为适应所处生存环境黏附于非生物或活性组织表面成熟的生物膜包括以下几个特点：存在胞外聚合物，异质性，低pH，缺氧，过量分泌脂肪酶等特点［33］。

4.2基于感染性炎症微环境的精准纳米靶向给药系统设计目前应用比较广泛的抗炎纳米载药系统包括无机金属纳米粒子和有机纳米粒以及一些智能的纳米粒子，例如银抗菌肽等［34-35］，以及智能的环境触发型载药系统。还可以根据巨噬细胞具有炎症趋化的特性构建炎症部位的靶向的巨噬细胞修饰的纳米粒。

Wang等［36］构建了以交联聚磷酸酯为载药内核、聚己内酯为中间夹层包裹内核，聚乙二醇为外壳的三层结构的纳米凝胶，其中聚己内酯中间层可以被细菌分泌脂肪酶催化降解，导致药物迅速释放，从而有效杀死细菌。结果表明，当万古霉素浓度为10µg/mL时，12 h和24 h后载万古霉素凝胶组的菌落形成单位比万古霉素的分别低7倍和22倍。

5 结 语

纳米药物载体根据材料、结构等差异，可以分为无机纳米材料和有机纳米材料。无论是无机纳米材料还是有机纳米材料都存在体内易被网状内皮系统清除的问题，近些年来，细胞外囊泡、细胞膜等内源性仿生纳米材料的出现，为纳米药物递送系统提供了新思路，但是仍然存在一些不足，例如细胞外囊泡作为纳米载体，存在产量低，成本高，载药率低等缺点，细胞膜仿生纳米递送系统的构建也要求内核为负电性的纳米材料，这使得联合带负电性的基因药物的治疗带来难度。那么如何利用不同纳米材料的功能特点结合不同疾病微环境特点设计载药量高、生物相容性好、毒性低以及免疫原性低的智能纳米载药系统，实现精准靶向以及药物的可控释放仍然还有很长的路需要走。由于疾病在不同进展阶段的治疗的复杂性，例如普遍的耐药现象，肿瘤的转移和复发等治疗上的难点，这也使得纳米精准靶向治疗也面临着诸多挑战。相信随着纳米载体技术的不断进步，分子生物学的发展以及人们对肿瘤及一些高发的AS和常见的感染性炎症、糖尿病、高血压等危害人类健康的疾病的发病机制和治疗靶点的认识越来越深入，精准纳米靶向载体系统在疾病的多学科综合治疗上将具有广阔的研究和应用前景。