内源性代谢物靶标发现及其在精准靶向肿瘤治疗中的应用前景

叶 慧,郝海平

0 引 言

肿瘤中代谢物水平与正常细胞相比存在显著差异。越来越多的研究表明，致癌信号通路与代谢活动之间存在紧密联系［1-2］，代谢重编程在癌症中的重要性正日益得到承认。代谢重编程使肿瘤细胞高度依赖于特定代谢通路、代谢酶，而代谢物除了作为代谢转化中的中间体，也可通过直接或间接作用进一步触发肿瘤细胞的多种信号通路，对蛋白网络进行调控。研究表明，代谢物在细胞内往往存在多个作用靶标，而同一靶蛋白同时也可受到多种代谢物的共同调节［3］。因此，在复杂的肿瘤代谢网络中明确功能性代谢物的作用靶标与调节机制成为肿瘤靶向治疗的新途径。随着质谱技术的发展，其在小分子靶标发现领域显示出卓越的优势。目前，基于质谱的小分子药物靶标发现方法按照是否对小分子进行官能基团的修饰这一标准可分为非修饰及修饰的靶标发现方法。也有研究者将这些方法应用于内源性代谢物的靶蛋白发现的研究中［4-5］。为促进内源性代谢物靶标发现在肿瘤靶向治疗策略开发中的研究，本文将对肿瘤内代谢紊乱的特点，代谢调节对肿瘤的影响及现有基于质谱的内源性代谢物靶标发现方法进行阐述，以突出内源性代谢物在肿瘤治疗中的关键作用，为肿瘤治疗提供新方向。

1 代谢调控治疗肿瘤

在正常生理条件下，细胞的能量来源于葡萄糖的氧化分解，而在缺乏氧气的生理条件下，细胞的能量来源会切换至葡萄糖的糖酵解通路。早在20世纪初时，Warburg［6］研究发现，即使处于氧气足够的环境之中，肿瘤细胞依然选择以糖酵解的方式为生长提供能量，即著名的Warburg效应。谷氨酰胺分解是肿瘤细胞第二大能量来源方式，其催化、脱氢过程中的中间产物可参与三羧酸底物循环，从而为肿瘤细胞供能［7］。此外，肿瘤细胞为了维持自身增殖所需的高能量，也会增强脂质代谢通路［8］。这种肿瘤代谢模式的重编程现象的终极目的是为了满足肿瘤快速生长和增殖过程中所需要的大量能量和生物合成原料［6］。

基于肿瘤与正常组织相比的代谢差异，研究人员尝试靶向肿瘤细胞内能量代谢通路，以期通过阻断供能通路产生抗肿瘤作用，实现肿瘤靶向治疗。如Wang等［9］针对丝氨酸合成通路中磷酸甘油脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）进行结构及其功能研究，通过设计小分子肽抑制剂靶向调控肿瘤代谢中的丝氨酸合成通路以治疗肿瘤。目前已有PHGDH的靶向制剂NCT-502和NCT-503能够通过靶向丝氨酸合成通路对抗肿瘤［10］。基于通过精准靶向肿瘤中异常活跃的糖代谢、NAD+合成、谷氨酰胺代谢、脂肪酸合成等肿瘤代谢通路来抑制肿瘤生长的策略，目前已有多种代谢酶抑制剂/激活剂类药物正处于临床或临床前研究阶段［11-12］。

除经典的糖酵解、谷氨酸代谢通路，研究发现肿瘤细胞内某些内源性代谢物能够通过结合并非其上下游合成/代谢酶等新靶标调控其活性，在肿瘤的发生、发展和免疫调节中发挥作用［4］。如2-羟基戊二酸（2HG）是异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变的产物，在胶质母细胞瘤中由于IDH酶的突变产生蓄积。Evans和Griner［13］研究发现，2HG可以通过竞争性结合α-酮戊二酸依赖的酶，导致包括组蛋白去甲基化酶、甲基胞核嘧啶双氧化酶和脯氨酸羟化酶等活性失调，进而导致肿瘤发生全基因组组蛋白和DNA甲基化改变。目前，针对介导2HG代谢物生成的IDH酶突变体开发的Enasidenib已获批用于治疗急性髓性白血病。这提示我们研究肿瘤中异常表达的致癌代谢物2-HG及其作用靶标为肿瘤治疗提供了新的策略和途径。

在免疫调节方面，Kornberg等［14］曾发现富马酸二甲酯可以催化糖酵解代谢酶GAPDH琥珀酰化使其失活，从而下调活化的髓细胞和淋巴细胞中的有氧糖酵解，介导其抗炎作用，揭示了富马酸二甲酯对免疫调节的机制作用。Galván-Peña等［15］学者研究发现内源性代谢物丙二酰辅酶A在LPS刺激的巨噬细胞中催化GAPDH丙二酰化，释放与GAPDH结合的TNFαmRNA，促进TNFα翻译，进一步加重炎症。Geiger等［16］学者发现内源性代谢物L-精氨酸参与调节T细胞代谢。激活的T细胞中L-精氨酸含量的提升可诱导细胞代谢方式从糖酵解转变为氧化磷酸化，促进T细胞存活。进一步，该研究在体外和体内模型均证实了T细胞内的精氨酸浓度直接影响了其代谢适应性与存活能力，进而发挥抗肿瘤活性，在体抑制肿瘤的生长。因此，对于免疫细胞的代谢物靶标发现为通过激活肿瘤患者的免疫系统发挥抗肿瘤活性的治疗策略提供了新的可能。

上述研究均表明，通过调控肿瘤及免疫细胞代谢对抗肿瘤的研究策略对于抗肿瘤药物研发具有巨大的科学和转化价值。然而，大多数在肿瘤中异常表达的功能性代谢物的作用靶标及对机体的调控机制尚不明确，对其直接作用靶标认识的缺失阻碍了通过调控肿瘤和免疫代谢进行抗肿瘤药物研发的深入，提示我们针对内源性代谢物的体内作用靶标发现技术亟待突破。

2 内源性代谢物靶标发现方法

肿瘤细胞会通过代谢模式的改变来适应自身增殖的需要。鉴于阐明致癌信号通路与代谢活动之间复杂的相互作用机制在抗肿瘤药物研发中的重要作用，建立调控肿瘤代谢的关键内源性代谢物的靶标发现方法将成为肿瘤精准治疗研究的关键技术和突破口。

2.1非修饰方法寻找内源性代谢物靶标药物亲和致靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）是不对目标化合物进行修饰的靶标发现策略中经典的方法之一。2009年，Lomenick等［17］基于小分子与靶蛋白的亲和作用增加靶蛋白结构的稳定性，从而抵抗蛋白酶水解这一原理，基于凝胶电泳、染色和质谱鉴定识别出目标小分子的作用靶点。该方法的优点在于不仅不需要标记和修饰目标分子，还能广泛应用于各种天然状态的生物体系。2017年，Li等［18］采用DARTS方法，运用代谢组学和蛋白质组学技术发现了内源性小分子代谢物丁酸的靶蛋白丙酮酸激酶，阐明丁酸通过诱导结肠癌细胞的代谢重排，限制其增殖所需的生物原料的获得，最终抑制结肠癌细胞增殖的代谢调控机制。尽管应用广泛、操作简便，但DARTS方法有自身的局限性，包括不适合用于发现与目标分子的结合亲和力较弱的靶蛋白，以及无法用于发现与靶分子结合后构象没有发生显著性变化的靶标等问题。

细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是基于目标小分子与靶蛋白结合后靶蛋白的热稳定性增加，借助定量质谱技术发现和识别目标分子结合的靶蛋白。该技术能在天然的细胞环境中进行，也无需对目标分子和蛋白进行任何修饰以及标记。目前已证实该技术能识别许多已知的抗癌试剂的靶点，如在细胞裂解液、完整细胞或组织样本中均鉴定出甲氨喋呤、雷替曲塞、TNP-470的作用靶标。在内源性代谢物方面，Hashimoto等［19］验证了内源性小分子L-乳酸可以与跨膜蛋白SLC16A1结合并起到稳定蛋白构象的作用。然而，CETSA方法不适用于高度不均匀的蛋白质或蛋白质配体结合域的结构展开，并不会诱导蛋白的聚集和变性的情况，如DNA和伴侣蛋白质的结合［20-21］。

蛋白有限水解质谱（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）通过在复杂生物体系中识别由于配体结合引起蛋白质结构的改变，导致限制性酶切程度的变化，从而识别出药物结合的靶蛋白及其作用位点。该方法的优点在于当与靶向蛋白组学测量工具串联使用时，可在蛋白质组层面实现高灵敏度、可重复性、高通量的靶点筛选，且不需要对配体进行化学修饰［22］。Feng等［3］通过LiP技术发现内源性代谢物FBP可以通过结合Cdc19蛋白改变其构象并进一步激活其代谢酶活性，此外还鉴定出内源性代谢物FBP新的靶蛋白Fas1/2，并在体外实验中验证了FBP对其酶活的影响。然而，LiP-MS对靶标的检测受靶蛋白丰度的影响，当靶蛋白以较低的丰度存在于复杂的生物基质中，LiP-MS对靶标的检测存在难度［20］。此外，限制性酶切质谱方法提供的结构信息有限，且在对细胞中蛋白的处理过程中可能会引起靶蛋白的结构改变，从而产生假阳性结果的可能性难以完全规避［23］。

与上述方法相比，非变性质谱技术是一种非标记的分析技术，其特点在于能够直接观测到目标分子与靶蛋白的结合。该技术利用电喷雾电离将非共价复合物从溶液中转移到气相中，再通过测量配体和蛋白复合物的信号，并结合计量数获取目标分子与靶蛋白结合的亲和力［24-25］。Gan等［26］通过非变性质谱技术发现细胞裂解液中PHGDH可与4个NAD+分子结合，氧化还原酶CBR3蛋白也存在与NADPH结合的形式，发现了NADPH的新结合靶点。此外，Zheng等［27］还基于非变性质谱技术，开发了原态-变性交换质谱（Native-Denatured Exchange-Mass Spectrometry，NDX-MS）的方法，实现进一步区分特异性和非特异性的相互作用，以期发现小分子的特异性结合蛋白［28］。但该方法对仪器的要求较高，对样品的纯度以及同质性方面的要求也对其广泛应用于靶标筛选有所限制。

2.2基于修饰目标分子的方法寻找内源性代谢物靶标亲和纯化色谱是用于识别蛋白质和配体相互作用最为经典并广泛使用的方法之一。传统的亲和层析是将感兴趣的目标药物或小分子配体通过可衍生化的官能团固定在固相基质上，将修饰后的固相介质与细胞裂解液孵育，使得药物或小分子选择性的与靶蛋白结合，用洗脱液除去不与目标小分子结合的蛋白，利用变性剂或竞争性的游离药物洗脱靶蛋白，进而用质谱鉴定靶标［29-30］。该方法成功运用于多种小分子的靶标发现研究。Trzoss等［31］发现天然产物半醌对黑色素瘤细胞系具有选择性细胞毒作用，通过亲和纯化色谱方法鉴定出其结合的靶蛋白为皮离蛋白。该作用靶标的明确为开发治疗黑素瘤提供了新思路，而使用皮离蛋白作为开发靶向疗法的生物标志物则可以加速个性化治疗的发展。但由于该策略的开始依赖于对目标化合物的修饰，而对目标小分子的修饰有可能会干扰其与靶蛋白的相互作用，故也存在局限。

基于亲和力的蛋白质分析（Affinity-based protein profiling，ABPP）是目前用于药物靶标鉴定的前沿化学蛋白质组学技术。它主要通过开发基于小分子结构进行化学修饰，如与荧光基团、亲和基团的连接而成的探针。该类探针能够在细胞环境直接与潜在的靶蛋白共价结合，或基于光交联反应与靶蛋白产生共价结合，通过亲和富集或通过凝胶电泳对与目标小分子产生结合的蛋白进行鉴定，即可获取目标分子的靶标信息。该类亲和探针在鉴定低丰度靶标方面有优异的能力，并能获取在细胞及组织内与目标分子产生原位亲和作用的靶蛋白信息。Hulce等［32］通过使用光亲和性甾醇类探针结合定量质谱方法，在HeLa细胞中鉴定出超过250种胆固醇的结合蛋白，并验证出其中7个代表性蛋白与胆固醇之间的相互作用。Moraru等［33］通过合成了糖代谢的副产物丙酮醛（methylglyoxal，MGO）探针，发现MGO的靶标为脂肪酸合成酶，阐明了由于MGO生成增加或是MGO解毒机制受阻引起的MGO水平上升抑制胰岛素信号诱导2型糖尿病的发病机制。

3 代谢物作用靶标的发现在开发肿瘤精准治疗新策略中的前景

由于疾病的异质性和患者的个体差异不同，肿瘤个体对药物的敏感性和耐药性也存在显著差异。为向患者提供副作用小而又最为有效的治疗，肿瘤精准治疗的概念应运而生。鉴于肿瘤细胞内明显的代谢重编程与肿瘤恶性程度、浸润和转移能力等特点密切相关，靶向肿瘤中异常活跃的代谢通路成为精准抗肿瘤药物的新靶点［34］。另一方面，在给予传统化疗药物的同时，共同给予代谢酶抑制剂/激活剂类小分子调节肿瘤代谢状态能够显著增强抗肿瘤药效，如抗肿瘤药物mTOR通路抑制剂雷帕霉素与糖酵解通路阻断剂3-BrOP的联用能够显著增强其对淋巴瘤与白血病细胞的杀伤能力［35］；降低葡萄糖水平能够增加多种肿瘤细胞系对5-FU和顺铂的药物耐药性［36］；L1210细胞中二氢叶酸水平的升高能够逆转甲氨喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制作用等［37］。但这种代谢水平变化增敏化疗药物的机制尚不完全明确。

因此，在“谈癌色变”的今天，深入探究肿瘤细胞中代谢重编程现象导致的内源性代谢物失衡，并基于修饰和非修饰蛋白组学进行代谢物的靶标发现研究，以探寻代谢物平衡失调与肿瘤发生、发展相关联的机制，进而根据肿瘤内源性代谢物在体内的作用靶标，促进基于代谢靶标的新药研发或开发与传统化疗药物共同给药的新模式这一研究方向具有重要的科学和转化价值，为临床肿瘤患者的个性化精准治疗提供了新的视角。