流行性感冒重症化机制研究及治疗进展

邹迁达 包佳琪 郑书发 陈 瑜

流行性感冒(influenza)，简称流感，是常见的急性呼吸道疾病，可引起流感世界大流行与季节性流行。20世纪以来全球曾暴发多次流感大流行，包括1918年西班牙流感(H1N1)、1957年亚洲流感(H2N2)、1968年香港流感(H3N2)和2009年猪流感(H1N1pdm09)，造成当时大量人口的发病与死亡。而据最新统计，每年有29万～65万人死于季节性流感相关的呼吸系统疾病[1]。由此可见，流感给全球带来了巨大的社会经济负担。大多数流感以轻微的上呼吸道表现为主且多为自限性，然而少数患者病情进展迅速，可并发重症肺炎、多脏器衰竭甚至死亡。病毒与宿主因素在流感重症化中的作用仍是当下的研究热点，相应的以抗病毒为主、免疫调节为辅的治疗策略也备受关注。本文就流感重症化机制及其治疗进展做如下综述。

一、流感重症化机制

1.病毒因素

(1)表面抗原变异：抗原漂移和抗原转换是流感病毒逃避宿主免疫攻击，引起流感流行的重要因素。流感病毒表面抗原基因的点突变称为抗原漂移，通常引起季节性流行。研究显示，流感病毒血凝素蛋白(haemagglutinin, HA)受体结合区上的一些点突变可增强病毒与人类下呼吸道α-2,3唾液酸受体的亲和力，使之更易附着于肺泡上皮细胞，其中HA D222G突变在H1N1pdm09重症感染中的检出率较高[2]。甲型流感病毒可发生抗原转换，即不同亚型病毒的基因片段重配成为新亚型。由于人群普遍缺乏对新型重组病毒的免疫力，若其能够在人群中传播将引发世界大流行[3]。此外，不同于低致病性流感病毒，一些高致病性毒株HA(H5、H7)裂解位点附近插入多个碱性氨基酸，能够被宿主细胞中普遍存在的弗林蛋白酶(furin)所识别、裂解，从而增强病毒的复制能力[4]。

(2)RNA聚合酶变异：流感病毒RNA聚合酶由碱性聚合酶1(basic polymerase 1, PB1)、碱性聚合酶2(basic polymerase 2, PB2)、酸性聚合酶(acidic polymerase, PA)3个亚基组成，是影响病毒毒力与宿主适应性的重要因素。PB1基因第二个可读框编码PB1-F2蛋白，该蛋白能够诱导细胞凋亡、抑制宿主早期免疫应答以及提高继发细菌性肺炎的概率。H1N1和H5N1中PB1-F2 N66S突变可延迟宿主体内干扰素的激活并加重肺部免疫病理损伤，是导致这两种流感高病死率的原因之一。PB2中E627K和D701N突变是禽流感病毒跨种属感染哺乳动物的重要因素，多项动物实验提示这些突变能够增强H5N1、H7N7和H7N9的毒力与宿主适应性。PA具有核酸内切酶活性，参与流感病毒起始转录的“CAP-snatching”过程。反向遗传实验发现其多个突变位点与各型流感病毒聚合酶活性提高有关，如I550L(H1N1pdm09)、N409S(H7N9)、G631S(H5N1)、K338R(乙型流感病毒)等[5]。

(3)耐药相关变异：基质蛋白2(matrix protein 2, M2)S31N和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)H275Y是两个常见的耐药突变，分别导致流感病毒对金刚烷类和神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors, NAIs)的敏感度下降。H3N2和H1N1pdm09流感病毒对金刚烷类耐药率>99%。自H1N1pdm09流感病毒取代NAIs耐药的季节性H1N1流感病毒进入全球流行之后，目前NAIs耐药率<2%，然而仍有少部分耐药毒株在社区散发流行的情况报道。另外，免疫功能低下患者在长期抗病毒治疗过程中易出现耐药突变，可致预后不佳。H7N9禽流感患者治疗过程中可出现继发性耐药(如R292K)，导致病毒载量再次上升，疾病进展[3]。印度一项最新的研究显示，27.3%感染H1N1pdm09死亡病例中检测到H275Y耐药突变株，而轻症病例中未发现该突变[6]。由此可见，耐药突变对流感疾病重症化及不良预后的影响值得重视。

(4)病毒细菌共感染：流感感染后肺上皮细胞坏死脱落，呼吸道物理屏障受损，鼻咽部的定植菌得以进入肺部引发二重感染。Li等[7]发现甲型流感病毒表面蛋白NA能够激活生长转换因子(transforming growth factor-β， TGF-β)进而上调宿主细胞表面纤连蛋白、整合素等黏附受体表达，使得细菌得以大量附着于呼吸道表面，随后增殖播散，进一步加重肺部感染。流感侵袭后，损伤的宿主细胞在修复过程中还可表达亚乙基化聚糖(asialylated glycans)、α5β1整合蛋白等顶端受体，为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等细菌提供结合位点[8]。此外，流感病毒能够影响宿主对细菌的固有免疫应答。研究发现机体在流感感染早期产生的Ⅰ型干扰素可抑制吞噬细胞识别与杀伤细菌，同时还可降低辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)及白细胞介素-17(interleukin-17, IL-17)、IL-2、IL-23对细菌的清除作用[9]。近年来，细菌共感染在流感重症患者中的发生率有所上升，是死亡相关的独立危险因素，其中检出率位列前五的分别为肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、曲霉菌和流感嗜血杆菌[10]。

2.宿主因素

(1)免疫反应：流感病毒入侵后被机体固有免疫系统所识别，进而激活下游信号通路，释放一系列促炎性细胞因子及趋化因子引发免疫应答。这些促炎因子随即招募中性粒细胞、单核-吞噬细胞、淋巴细胞等到达感染部位以对抗流感病毒。大量免疫细胞浸润可造成组织损伤与器官功能障碍，通常在随后得以修复。然而，部分患者体内过激的免疫反应，如“细胞因子风暴”，将导致严重的免疫病理损伤。流感重症病例中可观察到单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)、γ干扰素诱导单核因子(monokine induced by γ interferon, MIG)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(macrophage inflammatory proteins, MIP-1β)、γ干扰素诱导蛋白-10(interferon γ-inducible protein-10, IP-10)、IL-6、IL-8、IL-10、等炎性因子水平显著升高。此外，大量细胞/趋化因子溢入循环系统可引发全身性反应，如脓毒血症甚至多脏器衰竭[11]。

(2)遗传易感性：近来，研究人员通过高通量测序筛选出许多与流感重症化相关的宿主基因。干扰素诱导的跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein 3, IFITM3)是一直以来的研究热点，其单核苷酸多态性位点rs12252-C可使该蛋白截短从而削弱机体抑制病毒复制的能力。有研究者对IFITM3rs12252与流感相关的文献进行Meta分析发现，T>C突变可增加流感感染风险(重症流感: OR=1.69, 95% CI：1.23～2.33,P=0.001; 轻症流感: OR=1.46, 95% CI：1.13～1.87,P=0.004)。此外，该基因的多态性是白种人轻、重症流感和东亚人流感重症化的危险因素[12]。Lee等[13]发现IFITM33rs12252 CC基因型、Toll样受体3(toll-like receptors 3, TLR3)rs5743313 CC基因型、衰变加速因子(decay-accelerating factor, CD55)rs2564978 TT基因型与流感病死率升高相关。其中，同时携带IFITM3 CC基因型和TLR3 CC基因型患者的死亡风险升高近10倍。Chen等[14]通过全基因关联分析发现，rs4820294/rs2899292 GG单体型与半乳糖凝集素基因(lectin galactoside-binding soluble 1, LGALS1)mRNA高表达有关，是H7N9感染的潜在保护因素。此外，在小规模研究中也发现了相关易感基因，有的能够影响病毒复制，如TMPRSS2(rs2070788)、SERPINE1(rs6092)；有的参与了先天免疫调控，如IL-1A(rs17561)、IL-1B(rs1143627)、IL-10(592C、1082A)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)(238A、308G)、干扰素调节因子-7(interferon regulatory factor-7, IRF-7)杂合复合突变等[15]。

二、治疗研究进展

1.抗病毒治疗

(1)用于临床的抗病毒药物:目前临床上广泛使用的抗病毒药物是NAIs，其以NA为靶点阻止子代病毒释放，对甲、乙型流感病毒均有效。一项针对H1N1pdm09住院患者的Meta分析显示，与未接受抗病毒治疗比较，NAIs治疗组的死亡风险下降；与延迟治疗比较，早期治疗(发病48h内)可显著降低病死率[16]。对重症流感来说，早期治疗能够降低ICU病死率，且在发病5天内予以NAIs治疗仍可从中获益。目前，重症流感抗病毒治疗的最佳持续时间及剂量仍存在争议，普通流感NAIs推荐疗程为5天，而有关重症病例的临床数据有限。有研究显示重症患者的病毒排毒时间延长，提示抗病毒时间可能需要加长[17]。一项不同剂量奥司他韦治疗重症流感的多中心研究显示，双倍剂量组与标准剂量组在病毒清除率、重症监护时长、机械通气时长及病死率方面比较无明显优势[18]。结合上述研究及专家共识，重症流感应尽早开始抗病毒治疗，其疗程可依据临床症状及病毒清除情况予适当延长，高剂量NAIs可能无法提供额外的临床效益。NAIs主要包括4类：①扎那米韦(zanamivir)为吸入制剂，是首个批准使用的NAIs；②奥司他韦(oseltamivir)为口服给药，是目前临床上一线抗流感药物；③帕拉米韦(peramivir)为静脉给药，主要用于重症流感或无法胃肠给药患者的治疗；④拉尼米韦(laninamivir)为吸入制剂，目前仅在日本批准用于临床[3]。

金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)属于M2离子通道阻滞剂，能够阻止甲型流感病毒RNA进入宿主细胞核进行复制转录。金刚烷类对乙型流感病毒无效，目前流行的甲型流感病毒对其耐药率>99%，故不推荐单独使用。阿比朵尔(arbidol)可抑制流感病毒复制早期的膜融合以阻止病毒进入宿主细胞，另外它也具有一定免疫调节功能，目前主要在俄罗斯用于流感的治疗[19]。

(2)研究中的抗病毒药物：以流感病毒感染不同阶段为靶标的新药物正处于研发或临床试验阶段，有望在不久的将来为治疗重症流感提供有效途径。DAS181(fludase)是一种唾液酸酶重组蛋白，能够裂解宿主细胞表面唾液酸受体以阻碍病毒吸附，对H1N1pdm09、H5N1以及奥司他韦耐药株等均具有抑制活性。Ⅱ期临床试验示DAS181可显著降低患者体内病毒载量并缩短排毒时间[20]。硝唑尼特(nitazoxanide)最初用于寄生虫病的治疗，近年来研究发现其能够阻止流感病毒表面蛋白HA的成熟从而抑制病毒复制。该药在体外实验中可与NAIs协同作用于耐药毒株。Ⅱb/Ⅲ期临床试验发现硝唑尼特可缩短患者流感样症状持续时间[21]。VX-787是一种仅针对甲型流感病毒PB2帽子结合位点的抑制剂，可以阻碍病毒核酸转录。临床研究示该药能有效缩短流感病毒排毒时间和症状持续时间，减轻疾病严重程度[19]。Baloxavir marboxil(S-033188)可抑制流感病毒PA亚基核酸内切酶活性以抑制病毒转录与复制。近期公布的Ⅲ期临床试验显示该药治疗组流感样症状缓解时间较安慰剂组显著缩短，病毒效价下降速度较奥司他韦治疗组快。另一项针对重症流感高危人群的Ⅲ期临床试验正在进行中(NCT02949011)[22]。VIS410是一种靶向HA的单克隆抗体，其在小鼠实验中可有效改善肺部H7N9的清除，限制病毒扩散进而减轻急性肺损伤，在重症流感中具有一定治疗前景。目前一项有关VIS410与奥司他韦在需要给氧治疗的H1N1pdm09流感患者中的疗效评估正在开展(NCT03040141)[23]。

2.免疫调节治疗

(1)用于临床的免疫调节剂：糖皮质激素作为常见的免疫抑制剂用于治疗重症流感，但目前对其临床疗效评价褒贬不一。有研究认为糖皮质激素可以改善临床症状，但大多数研究显示它似乎并没有带来太多益处。Yang等[24]对已发表的19项临床研究分析发现，糖皮质激素治疗与流感患者机械通气和重症监护时间延长、继发感染概率增加以及病死率升高有关。H7N9感染合并肺炎的研究显示，高剂量糖皮质激素组(>150mg/d甲泼尼龙或其他等剂量激素)患者30天及60天病死率高于对照组，且病毒排毒时间延长；而中低剂量糖皮质激素组(25～150mg/d甲泼尼龙或其他等剂量激素)与对照组比较差异无统计学意义[25]。另一项回顾性分析显示[26]，在合并肺炎且PaO2/FaO2<300mmHg的H1N1pdm09流感患者中，中、低剂量糖皮质激素可降低30天及60天死亡风险。糖皮质激素主要用于重症流感的治疗且目前有关研究多为回顾性分析，故存在一定偏倚，如患者基础情况、治疗起始时机、激素种类及剂量等。Delaney等[27]对607例重症H1N1pdm09流感患者研究发现，糖皮质激素治疗会增加病死率(OR=1.82, 95%CI:1.21～2.74,P=0.004)，而经过统计模型控制时依性混杂后该差异消失(OR=0.96, 95%CI:0.28～3.28,P=0.950)。因此，进一步研究需扩大样本量，控制基线与混杂因素，为糖皮质激素在重症患者中的临床应用提供科学依据。静脉免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIg)具有调理吞噬和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用，常用于严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)、埃博拉病毒病等重症感染性疾病的治疗，也应用于重症流感。香港一项随机对照研究表明，H1N1pdm09感染的重症患者发病5天内予以超免疫球蛋白(H-IVIg)治疗可有效降低病毒载量及患者病死率。

(2)研究中的免疫调节剂：现有的免疫调节剂在重症流感中也可起到一定辅助作用。核素受体超家族中的过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)具有α、β和γ 3种亚型，最初用于脂质与葡萄糖代谢的调节，近年来发现其具有炎症抑制作用。动物实验发现，PPAR-α激动剂如吉非贝齐和PPAR-γ激动剂，如噻唑二酮类和黄酮类异甘草素，可下调流感感染小鼠肺部细胞/趋化因子表达水平，提高存活率。鞘氨醇-1-磷酸1亚型(sphingosine-1-phosphate 1, S1P1)是一类参与固有免疫应答的重要信号分子。H1N1pdm09感染雪貂实验发现，S1P1受体激动剂可减轻流感样症状和肺部免疫病理损伤，且与奥司他韦联用效果更为显著。各类非甾体类抗炎药也被证实在流感感染中起到免疫调节作用。尼美舒利可抑制H5N1禽流感病毒复制以及受感染细胞中的炎性反应。塞来昔布、美沙拉嗪与扎那米韦的三联疗法可降低H5N1感染小鼠体内炎性因子水平，提高存活率。大环内酯类抗生素除了抗菌作用以外，还可下调体内炎性因子水平，抑制信号转导，以及调节免疫细胞功能。一项多中心研究显示，接受奥司他韦-阿奇霉素联合治疗的患者血浆中IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、MIG和C反应蛋白水平显著降低，同时体外实验也证实联合给药可有效降低IL-6和IL-8水平，而病毒载量下降趋势比较差异无统计学意义。此外，还有一些抗氧化剂、抗TNF制剂、他汀类药物及中草药在体外实验中表现出一定潜在免疫调节能力，它们在重症流感中的疗效有待进一步临床验证。

综上所述，流感病毒可造成每年的季节性流行和多次暴发流行，特别是重症化的流感仍是当前临床面临的棘手问题。充分认识流感病毒与宿主因素在疾病重症化中的机制，从监测病毒变异、控制细菌共感染、干预免疫调控、识别宿主易感基因等多方面着手，对防治重症流感具有重要指导意义。目前，靶向流感病毒感染不同阶段的抗病毒药物，以及现有免疫调节剂在重症流感中的免疫调控作用的研究均取得较大进展。今后仍需进一步开展相关临床验证，积极探索流感重症化机制并予以针对性治疗，为应对重症流感提供最优策略。