中脑多巴胺能神经元自身受体DRD2的功能与调控

杨 璇 王玉波 张 云 贾 丁 张正慧 宋彬彬 于 佳

一、DRD2的结构

多巴胺受体D2(dopamine receptor D2，DRD2)编码基因位于11号染色体q22～23，编码415～444(鼠)、414～443(人)个氨基酸，DRD2基因可编码产生剪接变异体，即短型(D2S)和长型(D2L)，D2L比D2S在第3胞内环处多29个氨基酸序列。DRD2属于G蛋白偶联受体，由7个跨膜区域组成。DRD2的氨基端位于胞外，包含有4个N-糖基化位点。羧基端与位于胞内，包含有多个丝氨酸、苏氨酸残基位点，可被激酶磷酸化；在DRD2的第3胞内环也存在多个磷酸化位点，这些位点的磷酸化参与了激动剂依赖的受体去敏感化以及第四胞内环的形成[1]。

二、DRD2在中枢神经系统的分布以及亚细胞分布

DRD2广泛分布于中枢神经系统中。DRD2高表达于纹状体、伏隔核、嗅球，在大脑皮质、基底前脑、边缘系统、下丘脑、后脑表达较低[1]。DRD2还表达于中脑多巴胺能神经元中。检测发现敲除中脑多巴胺能神经元中的DRD2可使大脑中DRD2含量下降20%；而敲除纹状体神经元中DRD2则可使大脑中DRD2含量下降约70%，表明DRD2在中脑的表达也相对较低[2]。在神经元中，DRD2主要分布于胞膜上，但胞质内也有DRD2，可能主要是位于内体[3]。近年来的研究表明，DRD2在多巴胺能神经元胞膜中并不是弥散分布的。Robinson等[4]观察到DRD2基因敲入小鼠中脑多巴胺能神经元中胞体胞膜和树突膜上的DRD2呈点状聚集分布。此外，Sharma等[3]利用生化实验证实在HEK293T细胞膜上有一部分DRD2存在于某种微结构中，不易于其他膜蛋白发生相互作用。上述结果提示，DRD2与其他G蛋白偶联受体的分布有所不同，其功能的发挥可能也具有一定特殊性，这也是未来需要进一步研究的问题。

三、多巴胺能神经元中存在DRD2自身受体

早在1976年多巴胺自身受体的概念就已经被提出，人们发现多巴胺受体激动剂可以抑制多巴胺的释放；而通过利用多巴胺受体亚型特异性激动剂或抑制剂，人们发现DRD2可能是最主要的多巴胺自身受体。因此，为了明确DRD2的自身受体功能，研究者建立了 DRD2基因敲除小鼠并观察到与野生型小鼠相比，DRD2基因敲除小鼠表现为水平运动减少；在可卡因刺激下，野生型小鼠和DRD2基因敲除小鼠的运动均显著提高，但可卡因对DRD2基因敲除小鼠运动能力的提高要强于野生型小鼠。进一步研究发现，可卡因或电刺激下，DRD2基因敲除小鼠纹状体胞外多巴胺含量增加幅度高于野生型小鼠，提示DRD2可以调节小鼠脑内多巴胺的释放[5]。

为了进一步明确DRD2在小鼠多巴胺能神经元突触前和突触后的作用，人们建立了选择性DRD2基因敲除小鼠。Anzalone等[2]研究发现在可卡因的刺激下，中型多棘神经元选择性DRD2敲除小鼠的运动功能与野生型小鼠相比明显下降，而中脑多巴胺能神经元选择性DRD2敲除小鼠运动功能则显著升高。DRD2激动剂喹吡罗可抑制野生型小鼠纹状体内多巴胺释放，但在中脑多巴胺能神经元选择性DRD2基因敲除小鼠喹吡罗的这一效应明显降低。但上述DRD2基因敲除小鼠在神经系统发育早期DRD2就已经表达缺失，这可能会导致神经系统的发育障碍，从而影响对DRD2功能的研究。因此，Budygin等[6]利用腺相关病毒包装的短发夹RNA敲减成年小鼠黑质中的DRD2，结果发现该小鼠同样表现为运动显著增强；DRD2拮抗剂氟哌啶醇可以显著增加对照组小鼠纹状体内多巴胺释放，但是这种效应在DRD2敲减小鼠中被明显抑制。上述结果提示，中脑多巴胺能神经元中的DRD2作为自身受体抑制多巴胺的释放和小鼠运动功能。

四、DRD2自身受体介导的细胞功能

1.DRD2自身受体调节中脑多巴胺释放：当多巴胺能神经元在刺激下释放多巴胺至突触间隙，可激活轴突上的DRD2自身受体，降低随后的多巴胺胞吐释放的概率，这一过程一般仅需几百毫秒到几秒[5]。轴突上的DRD2自身受体对多巴胺胞吞释放的抑制作用具有重要的生理意义，可限制动作电位持续爆发诱发的多巴胺过度释放。

多巴胺的胞吐释放和胞内钙离子浓度增加密切相关。研究表明，DRD2激动剂喹吡罗可明显抑制神经元的钙离子电流，DRD2的激活可以有效的抑制P/Q以及N型钙离子通道，降低突触前钙离子浓度，从而抑制突触前囊泡的释放[5]。此外，DRD2还可以不通过钙离子通道，而是钾离子通道调节突触前囊泡释放。Fulton等[7]利用免疫荧光染色观察到电压门控性钾离子通道Kv1亚基Kv1.2、1.3和1.6分布于多巴胺能神经元轴突，Kv1广谱抑制剂4-AP可以减轻喹吡罗对多巴胺能神经元释放多巴胺的抑制作用，提示Kv1参与介导了DRD2的自身受体功能。进一步研究发现 Kv1.2亚基拮抗剂MTX几乎可以完全拮抗喹吡罗对多巴胺释放的抑制作用，提示Kv1.2亚基参与了DRD2对多巴胺释放的抑制。在基础条件下，Kv1.2基因敲除小鼠纹状体中多巴胺释放量明显高于野生型小鼠，且Kv1.2基因敲除小鼠对喹吡罗不敏感，进一步证实了Kv1.2亚基参与了DRD2自身受体功能[7]。Kv1.2的激活可导致大量钾离子进入多巴胺能神经元中，使得神经元静息电位降低，神经元发生超极化，从而抑制多巴胺的释放。

多巴胺释放至突触间隙后，胞外的多巴胺清除主要是通过多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)，这也是避免胞外过量DA产生持续性神经兴奋毒性重要机制。研究发现，DRD2自身受体可以调节DAT的活性。Budygin等[6]研究发现利用腺相关病毒包装的短发夹RNA敲减成年小鼠黑质中DRD2可导致DAT活性降低。Benoit-Marand等[8]检测了前脑内侧束中多巴胺的半衰期，多巴胺的半衰期可反映DAT对多巴胺的再摄取活性，结果发现DRD2拮抗剂氟哌啶醇和依替必利可延长野生型小鼠多次电刺激诱发释放的多巴胺的半衰期，但是却对DRD2基因敲除小鼠无明显影响。此外，还有研究发现激活D2S提高了细胞膜上DAT含量[5]。但值得注意的是，DRD2拮抗剂氟哌啶醇和依替必利并未能改变DAT对单次电刺激诱发释放的多巴胺的再摄取，这一结果表明DRD2介导的DAT活性增强可能只在DRD2被过度持续激活时才会发生。

DRD2自身受体还可以调节多巴胺的合成。多个研究显示，DRD2激活可降低多巴胺合成限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)Ser40磷酸化水平，DRD2对TH Ser40磷酸化水平的调节是通过抑制环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)通路[5]。TH Ser40磷酸化水平和TH的活性呈正相关。DRD2拮抗剂氟哌啶醇和阿立哌唑增加而DRD2激动剂喹吡罗降低小鼠纹状体内的多巴胺合成[5]。多巴胺合成降低可能会导致突触前囊泡中多巴胺含量降低，进而抑制多巴胺的释放。

在刺激或静息状态下均有多巴胺在胞体和树突中释放。胞体和树突释放的多巴胺可激活DRD2自身受体，促使Gβγ和Gα解离释放入胞质，Gβγ可与G蛋白门控内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels，GIRK)胞质结构域结合从而激活GIRK。在黑质和中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元中均有有GIRK表达。GIRK激活会导致大量钾离子内流，多巴胺能神经元膜电位发生强烈超极化，多巴胺能神经元停止放电，从而抑制多巴胺释放[9]。

2.DRD2自身受体调节多巴胺能神经元的发育和存活:研究发现胚胎发育期DRD2基因敲除小鼠中脑多巴胺能神经元数目与野生型小鼠相比明显降低，而喹吡罗处理可以提高野生型小鼠中脑多巴胺能神经元数量，促进神经突起生长，提示多巴胺能神经元中DRD2自身受体可能促进了多巴胺神经元的发育。

Wiemerslage等[10]研究发现，DRD2激动剂喹吡罗可减轻MPP+所诱导的果蝇多巴胺能神经元损伤；而当在多巴胺能神经元中DRD2被敲减，喹吡罗则不能减轻MPP+诱导的损伤。Bellucci等[11]发现糖剥夺处理导致SY5Y细胞中α-突触核蛋白发生纤维状聚集，并伴随有细胞死亡，而喹吡罗则可以明显抑制糖剥夺诱导的细胞死亡。上述研究提示多巴胺能神经元中的DRD2自身受体还可能介导了神经保护作用。

多巴胺能神经元中的DRD2自身受体是通过何种机制促进多巴胺能神经元的发育和存活？研究发现，DRD2可通过激活ERK通路提高核相关受体因子(nuclear receptor related factor1，Nurr1)的活性，Nurr1在多巴胺能神经元的发育和存活中起到重要作用[12]。因此，中脑多巴胺能神经元中的DRD2可能通过激活Nurr1促进神经元的发育和存活。此外，Tozzi等[13]发现喹吡罗可减轻鱼藤酮诱导的氧化应激损伤，包括钙离子积累、线粒体片段化、ATP合成降低；PKA的抑制剂H89也可以抑制上述损伤。据此可以推测，DRD2可能通过抑制PKA的活性以抑制氧化应激损伤，保护多巴胺能神经元。

五、D2L和D2S均可作为自身受体

为了确定D2L和D2S可否在中脑多巴胺能神经元中作为自身受体发挥功能，Radl等[14]同时建立了D2S基因敲除小鼠和D2L基因敲除小鼠，并观察到喹吡罗可以有效抑制野生型和D2L基因敲除小鼠的运动能力，但是对D2S基因敲除小鼠的运动无明显影响；氟哌啶醇可以诱导野生型和D2S基因敲除小鼠出现僵直行为，但是却对D2L基因敲除小鼠无效。根据以上证据，研究者认为D2L主要分布于多巴胺作用的靶神经元，介导突触后功能；而D2S主要分布于中脑多巴胺能神经元，作为自身受体调节多巴胺释放。

但是也有证据表明，D2L也表达于多巴胺能神经元并发挥自身受体功能。Jang等[15]利用RT-PCR检测发现小鼠黑质中同时有D2L和D2S表达，且D2L的mRNA水平明显高于D2L。喹吡罗可以明显抑制表达D2L或D2S的中脑神经元放电，且这种抑制作用在D2L和D2S阳性神经元中无明显差异。Neve等[16]利用腺相关病毒在DRD2基因敲除小鼠黑质中表达D2L或D2S，结果发现D2L或D2S均可使DRD2基因敲除多巴胺能神经元的自身受体功能回复。因此可以推测，D2L和D2S均表达于中脑多巴胺能神经元中发挥自身受体功能。

D2L比D2S在第3胞内环处多29个氨基酸序列，鉴于第3胞内环包含多个翻译后修饰位点，因此D2S和D2L可能具有不同的特性。Tabor等[17]利用全内角反射荧光显微镜在CHO细胞中观察到在激动剂刺激下，D2S发生内化的程度要明显高于D2L。Gantz等则发现胞内钙离子可促使D2S发生去敏感化，但对D2L却无明显影响，即胞内钙离子的增加可导致D2S的自身受体功能被抑制，而D2L却依然可以发挥自身受体功能。

此外，第3胞内环对于胞内信号转导起着重要作用，因此D2S和D2L介导不同的胞内信号通路。DRD2通常和Gαi偶联抑制cAMP/PKA信号通路。TH Ser40、多巴胺和cAMP调节的磷蛋白(dopamine and adenosine 3′5′-monophosphate-regulated phospho-protein，Mr 32kDa, DARPP-32)Thr34都是PKA磷酸化作用靶点。在D2L基因敲除小鼠中，喹吡罗仍可降低小鼠多巴胺能神经元内TH Ser40磷酸化水平，但是DARPP-32 Thr34磷酸化水平无改变，提示D2L介导了DARPP-32 Thr34的磷酸化，而D2S介导了TH Ser40的磷酸化。DRD2的激活还可促进AKT和其负性调节蛋白蛋白磷酸酶2A形成复合体，使其失活。激活D2L可抑制AKT活性，而激活D2S则不会影响AKT活性[5]。上述D2L和D2S的差异可能对DRD2自身受体功能的发挥有重要意义，但是目前人们还未能阐明其生理意义以及导致这些差异的机制。

六、DRD2自身受体功能的调节机制

1.GRK2对DRD2自身受体功能的调节：DR的内化过程受到G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase, GRK)调节，当DR被激活后，会被GRK磷酸化，增加DR和Arrestin的结合能力，促使DR发生内化。Daigle等[18]建立了DRD2阳性神经元GRK2特异性基因敲除小鼠，并观察发现该小鼠纹状体中多巴胺释放量显著低于野生型小鼠，并且DRD2自身受体活性明显降低，提示GRK2可以调节中脑多巴胺能神经元中的DRD2活性。

2.其他膜受体对DRD2自身受体功能的调节：大麻素受体(cannabinoid receptor 1，CB1)受体和DRD2共定位与多巴胺能神经元的轴突末端、轴突、树突以及胞体中。CB1受体是一个7跨膜的G蛋白偶联受体，在中枢神经系统广泛表达，位于突触前膜的CB1可以调节神经递质的释放。O′Neill等[19]发现CB1受体激动剂WIN55212-2可以降低喹吡罗对多巴胺释放的抑制作用，提示激活CB1受体可以拮抗DRD2的自身受体功能。在纹状体神经元和HEK293细胞中，激活CB1受体降低了多巴胺和DRD2的结合能力，但是这一机制是否同样适用于多巴胺能神经元中的DRD2自身受体目前仍缺乏证据，需要进行验证。

Escobar等[20]利用免疫荧光染色观察在伏隔核中到κ阿片受体、DRD2和突触前标志物Syntaxin 1共定位，且κ阿片受体和DRD2双阳性的突触小体也表现为TH阳性，表明κ阿片受体和DRD2共定位于多巴胺能神经元的突触前。而κ阿片受体激动剂U69593可加速喹吡罗对多巴胺释放的抑制作用，表明κ阿片受体激活可促进DRD2自身受体功能。

此外，还有研究检测到痕量胺相关受体1(trace amine-associated receptor 1，TAAR1)的激活可以抑制多巴胺的释放。TAAR1分布于大脑边缘系统，如杏仁核、背缝神经核、中脑腹侧被盖区中。Leo等[21]观察到TAAR1基因敲除小鼠伏隔核中多巴胺释放量明显高于野生型小鼠，而TAAR1激动剂RO5166017可导致野生型小鼠伏隔核中多巴胺释放降低。进一步研究发现，在野生型小鼠中RO5166017可以增强喹吡罗对多巴胺释放的抑制作用，提示 TAAR1的激活也可以作用于DRD2，提高其自身受体功能[21]。

七、DRD2自身受体异常与神经精神疾病

DRD2自身受体表达异常与成瘾相关。Milella等[22]利用正电子发射型计算机断层显像(positron emission computed tomography，PET)检测发现在可卡因滥用者中脑内DRD2水平越低，其对可卡因渴求程度越高。Tournier等[23]研究发现黑质和中脑腹侧被盖区内天生DRD2表达降低的大鼠可能更易滥用药物。

DRD2自身受体表达异常还可能参与了帕金森病的发生。Dragicevic等[24]检测发现在帕金森病患者中黑质未变性死亡的多巴胺能神经元内DRD2 mRNA水平明显则增加，目前这一改变在帕金森病发病中的意义仍不明确。但已有临床证据显示DRD2激动剂罗平尼罗可能会延缓帕金森病病程的进展，提示黑质中未变性死亡的多巴胺能神经元内DRD2表达升高可能一种代偿性的保护机制。

八、展 望

多巴胺能神经元上的DRD2自身受体调节多巴胺的释放，还参与多巴胺能神经元的发育和存活。因此，目前研究者正致力于开发以DRD2自身受体作为靶点的药物，用于治疗帕金森病或干预药物成瘾。DRD2的两种亚型D2L和D2S均可发挥自身受体功能，但由于D2L和D2S的自身特性和所介导的胞内信号通路存在差异，其所介导的功能也可能有所不同，而今后对于这些差异的研究将会促使人们细化DRD2自身受体的功能，为进一步药物的开发提供实验和理论依据。此外，DRD2自身受体活性还受多个其他膜受体的调节，也就意味着DRD2自身受体的活性还可能与其他递质系统相关，揭示大脑中多种递质系统存在交互调节机制。而在未来对这些调节机制的研究将有助于进一步阐明神经系统中多巴胺受体的生理功能和病理意义，并可为药物靶点的开发提供新思路。