HPLC法同时测定牛黄清感胶囊中8种有效成分的含量

2019-02-25遆铁军霍金海朱立刚赵雪莹周有财王伟明

天津中医药大学学报 2019年1期

庄岩，遆铁军，霍金海，朱立刚，赵雪莹，周有财，王伟明

（1.黑龙江省中医药科学院中药研究所，哈尔滨 150036；2.黑龙江澳利达奈德制药有限公司，哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

牛黄清感胶囊是由黄芩、金银花、连翘、人工牛黄、珍珠母等5味药材组成，具有疏风解表、清热解毒的功效，用于外感风寒所致的感冒发热，咳嗽，咽痛[1]。研究发现其对甲型H3N2流感病毒具有抑制和预防的作用，对呼吸道合胞病毒（RSV）具有极强的预防作用，并且具有较好的临床疗效[2-3]，为了更好的把控制剂质量，尤其是加强黄芪，金银花，连翘主要药味的质量控制。笔者建立了牛黄清感胶囊的HLPC法同时测定牛黄清感胶囊中8种成分的含量测定[4-9]，从而对牛黄清感胶囊进行更全面的质量控制[10]。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters Alliance 2695系统，含四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱以及Waters Empower色谱工作站，Waters二极管阵列检测器（PDA 996）；Agilent C18（2）100A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱。

1.2 试剂与样品绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、连翘酯苷A、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品（批号分别为 L-007-160504、Y-067-160715，Y-070-161102、L-012-160603、H-019-161031、H-029-140729，均来自成都瑞芬思生物科技有限公司），黄芩苷对照品（批号110715-201016，中国食品药品检定研究院），黄芩素对照品（批号111595-200905，中国食品药品检定研究院），甲醇、乙腈为色谱纯（Merck公司），磷酸为分析纯，水为超纯水；黄芩、连翘及金银花药材购于哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司；牛黄清感胶囊由黑龙江奥利达奈德制药有限公司（批号为 17010301，17010302，17020301，17020303，17030303）。

2 实验方法

2.1 供试品的制备取牛黄清感胶囊内容物3 g，精密称定，加甲醇25 mL，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀滤过，取续滤液，即得。

表1 各成分线性回归方程

表2 牛黄清感胶囊8种成分含量

图1 牛黄清感胶囊中金银花成分含量测定结果

2.2 液相色谱条件Agilent C18（2）100A色谱柱：（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）进行梯度洗脱，0～5 min，5%A～5%A，5～15 min，5%A～10%A，15～20 min，10%A～14%A，20～50 min，14%A～18%A，50～70 min，18%A～25%A，70～85 min，25%A～30%A，85～110 min，30%A～50%A，体积流量1 mL/min检测波长350 nm，柱温40℃。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2 000。对照品溶液、样品溶液及各阴性样品溶液见图1-3。

2.3 对照品溶液的制备精密称取绿原酸，隐绿原酸，异绿原酸C，连翘酯苷A，黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷和汉黄芩素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成绿原酸 300 μg/mL、隐绿原酸 200 μg/mL、异绿原酸 C 206 μg/mL、连翘脂苷 A 203 μg/mL、黄芩苷204 μg/mL、黄芩素 203 μg/mL、汉黄芩苷 200 μg/mL、汉黄芩素206 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验取牛黄清感胶囊样品（批号17030303），按“2.3”项方法制备对照品溶液，精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录色谱图。计算8个色谱峰的峰面积及保留时间，结果表明8个对照品色谱峰面积及保留时间的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性实验取牛黄清感胶囊样品（批号17030303），分别于制备后 0、2、4、8、12、24 h 进样，共记录6个时间点的图谱。结果色谱峰面积的RSD小于2.0%。结果表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性实验取牛黄清感胶囊样品（批号17030303），按“2.1供试品溶液的制备”项下平行制备6份供试品溶液，依法测定8个色谱峰的峰面积，结果峰面积的RSD小于2.0%。结果表明该方法重复性良好。

图2 牛黄清感胶囊中黄芩成分含量测定结果

2.4.4 加样回收率实验精密称取“2.1”项已测知含量样品约1.5 g，分别加入一定量的绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘、对照品，按照“2.1”项下方法制备供试溶液，进样10 μL进行测定，结果绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、连翘酯苷A的平均回收率分别为 99.6%、99.3%、100.5%、100.2%、99.6%、100.7%、99.5%、99.2%。

图3 牛黄清感胶囊中连翘成分含量测定结果

2.4.5 线性关系考察精密吸取混合对照品溶液1、3、5、10、15、20 μL 进样测定；以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标进行线性回归，得隐绿原酸，绿原酸，异绿原酸C，连翘酯苷A，黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷和汉黄芩素苷的线性回归方程见表1。

2.4.6 阴性样品溶液的制备按2015年版《中华人民共和国药典》规定的牛黄清感胶囊制备方法分别制备缺少金银花、黄芩、连翘的阴性样品，按“2.1”项方法操作，即得阴性样品溶液。

3 样品含量的测定

取5批样品按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以外标法计算待测成分含量见表2，结果表明绿原酸，隐绿原酸，异绿原酸C，连翘酯苷A，黄芩苷，汉黄芩苷、黄芩素的含量均值分别为 1.139、2.793、2.631、31.695、93.123、1.903、0.440、0.305 mg/g。

4 讨论

本实验在流动相选择时，以甲醇－0.1%冰醋酸溶液、甲醇－0.5%磷酸溶液、乙腈－0.5%磷酸溶液等3种流动相系统分别进行试验，其中，乙腈－0.5%磷酸溶液分离效果最好。波长在254 nm条件下，黄芩苷峰过大，不易分开，波长350 nm下各峰比例良好，峰与峰间距良好，易于分辨，故确定350 nm为最佳测定波长。为保持色谱分析的一致性，设定柱温来控制不同实验环境下的色谱分析，分别考察了25、30、35、40 ℃柱温下的分离情况，结果表明，柱温40℃时分离效果较好。最终，建立牛黄清感胶囊的HLPC法同时测定牛黄清感胶囊中8个成分的含量。不同流动相的色谱图。