大麦发芽期耐盐性种质鉴定及其生理响应特征分析

孙 建，徐晓芸，马增科，何建军，汪军成，姚立蓉，李葆春，马小乐，司二静，杨 轲，王化俊，孟亚雄

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

土壤盐渍化是抑制作物生长、造成作物减产的主要非生物胁迫之一[1]。我国耕地盐渍化面积达到0.05亿hm2,占全国耕地面积的6.1%，且土壤盐渍化危害面积和程度均有逐年提高的趋势[2]。国内外研究证明，筛选耐盐性品种，利用生物治盐、改盐是改善生态环境、提高盐渍化土地利用率的一条有效途径，选育高耐盐性作物显得尤为重要。

盐胁迫对植物种子的萌发、生长发育和基因表达均造成不同程度的影响。高盐浓度抑制小麦种子的萌发和幼苗的生长, 随着盐浓度的增加，幼苗长度和主根长度逐渐降低[3]。苗期种子在发芽阶段的耐盐性是耐盐作物筛选与早期鉴定的重要依据，也是决定植株能否在盐渍化土壤中生存的关键[4]。彭智等[5]通过对小麦种质材料的筛选和鉴定，得到了小麦芽期耐盐性鉴定的最适 NaCl 溶液浓度和苗期耐盐性鉴定的最适土壤 NaCl 浓度。同时，植物主要通过根系限制盐分的进入和调整根的分布来适应盐胁迫[6]，小麦、水稻则通过调节根系 K+吸收系统而维持叶片具有较高的K+/Na+值[7-8]，以进行渗透调节来建立植物体内离子稳态也是重要的耐盐性机制之一。关于盐胁迫对大麦苗期的种质筛选和鉴定[9-11]大多侧重于对数量性状和生物量的研究，而对大麦种质材料的生理特征响应的研究较少。

大麦(HordeumvulgateL．)是世界上栽培历史最悠久的作物之一，主要用作饲料、粮食、啤酒工业、医药工业和保健食品开发的原料，也是禾本科植物中较为耐盐的作物。获得优异的耐盐种质，培育耐盐作物新品种是解决土壤盐渍化问题的有效措施之一[12]。因此，耐盐种质的筛选、鉴定和评价就显得尤为重要。本实验在2017年对不同大麦材料大田耐盐性鉴定的基础上筛选采集的不同耐盐材料，于2018年进一步对大麦发芽期耐盐特性进行评价，分析筛选出的高耐盐性、盐敏感性两种极端类型材料盐胁迫响应的生理学特征，以期为耐盐大麦新品种的培育提供种质资源和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年7—9月在甘肃农业大学智能温室进行，供试126份大麦材料由甘肃省干旱生境作物学重点实验室麦类育种课题组提供，详见表1。

1.2 试验设计

1.2.1 种子发芽期耐盐材料筛选 将灭菌后的种子均匀摆放于铺有2层滤纸的培养皿中，每皿50粒，然后每皿添加10 mL 200 mmol·L-1NaCl的培养液，3次重复，以不添加NaCl的培养液处理为对照，最后置于昼/夜温度23℃/18℃，湿度50%～60%，光周期14 h，光强为400～500 μmol·m-2·s-1的人工气候室中培养，每天更换培养液，观察种子发芽情况并记录。以生根长芽，且芽长等于种子长度的1/2作为发芽标准。在开始萌发后第3天统计种子发芽势，第7天统计种子发芽率，并在发芽第7天测量幼苗株高、根长和统计总根数(表2)。

表1 种质材料

通过统计分析不同大麦材料在盐胁迫下种子发芽势、发芽率、株高、根长、根数变化，比较不同大麦材料间在发芽期性状的差异，综合评价大麦材料在发芽期的耐盐性，并筛选出高度耐盐性、盐敏感性这两种极端种质类型。

1.2.2 不同耐盐性大麦发芽期生理响应特征比较 以1.2.1节所述的方法筛选出的高度耐盐性和盐敏感性两类极端大麦种质为材料，采用常规方法萌发，待种子萌发5 d后，选择长势一致的幼苗转移到盛有10 L添加200 mmol·L-1NaCl 1/2 Hoagland 营养液(pH 6.5～6.8)塑料盆中进行盐胁迫处理培养，每2 d更换一次培养液，以不添加 NaCl 1/2 Hoagland营养液处理为对照，连续培养10 d。待培养结束后，每个处理选择15株，以5株为一个重复，测定株高、鲜重、干重，并分离地上部和根系，用根系扫描仪测定根长、根数、根表面积等形态学参数。随后将根系和地上部105℃杀青，80℃烘干至恒重，研磨成粉末状，用日本日立U-5100比例光束分光光度计测定Na+、K+含量。

以高度耐盐性和盐敏感性这两种材料在盐胁迫水培环境下幼苗株高、鲜重、干重、根系形态参数(根长、根数、根表面积)和地上部、根系Na+、K+含量等指标为依据，探究不同耐盐性大麦幼苗对盐胁迫响应的生理特性[13]。

1.3 数据处理

运用SPSS 19.0进行数据处理和统计分析，用Duncan’s法对各数据指标进行显著性检测，检测水平为P<0.05，采用隶属函数法全面地评价大麦品种(系)的耐盐性差异。

2 结果与分析

2.1 种子发芽期耐盐性鉴定

2.1.1 盐胁迫对大麦发芽及生长特性的影响 盐胁迫环境下，大麦发芽期各个性状指标的变化在不同程度反映了该材料耐盐能力的强弱[14]。由表2可知，200 mmol·L-1NaCl 胁迫下，大麦发芽势、发芽率、株高、根长和根数这些指标与对照相比均有不同程度的下降，且NaCl胁迫下变异系数较对照相比均增高，说明盐胁迫对不同材料的影响较大，各材料间差异明显。盐处理下的发芽势变化范围在0～0.97%，发芽率在0～0.90%，株高在0.24～5.67 cm，根长在0.15～3.62 cm，根数在1.07～2.89个。由此可见，本实验中各材料发芽期耐盐性存在广泛的遗传变异。

2.1.2 各材料发芽期性状方差分析 由表3和表4统计结果表明，盐胁迫处理对发芽期各性状影响显著，与对照相比，盐胁迫处理后的各材料间种子发芽势、发芽率、株高、根长和根数均达到了极显著差异(P<0.01)，基于此，可以确定各材料发芽期对盐胁迫响应差异明显，可进一步用于耐盐材料的筛选和鉴定。

2.1.3 各指标之间相关性分析 进一步对盐胁迫下以上各发芽期指标进行分析，针对每个材料，计算在盐胁迫处理和对照之间的种子发芽势、发芽率、株高、根长和根数的下降幅度，确定盐胁迫后的种子相对发芽势、相对发芽率、相对株高、相对根长和根数，并统计指标之间的相关性。由表5可以看出，各指标之间存在不同程度的相关性，相对发芽势与相对发芽率、相对株高、相对根长和根数均存在极显著正相关(P<0.01)；相对发芽率与相对根长、根数分别呈显著正相关(P<0.05)和极显著正相关(P<0.01)；相对株高和根数、相对根长和根数分别存在极显著正相关(P<0.01)。鉴于此，可以确定这些指标均可用作材料耐盐性鉴定的标准[15]。

表2 盐胁迫各品种发芽期各指标变化

表3 大麦材料发芽期发芽势、发芽率、株高性状方差分析

表4 大麦材料萌发期根长、根数方差分析

2.1.4 大麦材料发芽期耐盐性综合评价 在对以上大麦发芽期盐胁迫处理单一性状分析和不同指标之间相关性分析的基础上，进一步利用隶属函数分析法，将相对发芽势、相对发芽率、相对株高、相对根长和根数5个指标扩展到 [0，1] 闭区间上, 将数据标准化处理，并分别计算各耐盐指标的隶属函数值，进行综合聚类分析[16]。结果如图1所示，运用Pearson相关性，以平均距离20为界，将不同大麦材料划分为4个耐盐级别类型，其中类别I中包含高度耐盐材料33份，类别II中包含中度耐盐材料28份，类别III中包含中度盐敏感材料16份，类别IV中包含盐敏感材料49份。

表5 不同指标间相关性分析

2.2 不同耐盐性大麦发芽期生理响应特征比较

以上述耐盐性筛选结果为依据，在高度耐盐材料33份中选择1份ZDM655(Num185)，在盐敏感材料49份中选择1份ZDM222(Num33)，继续进行水培法盐胁迫处理，具体方法如1.2.2所述。

2.2.1 盐胁迫对不同耐盐性大麦生物量和含水量的影响 NaCl胁迫下，对不同耐盐性大麦鲜重、干重、含水量和根冠比进行分析比较，从表6可以看出，无论是高耐盐性材料，还是盐敏感性材料，其苗期生物量的分配均不同程度受到盐胁迫的影响[17]。就幼苗鲜重而言，盐敏感型材料在盐胁迫下的降低幅度远大于高耐盐性材料，与对照相比，分别下降了11.49% 和55.48%；高耐盐性材料在盐胁迫下干重与对照无显著差异，且要略高于对照，而盐敏感性材料则显著下降(P<0.05)；高耐盐性材料植株含水量在盐胁迫下略低于对照，但差异不显著，而盐敏感性材料则差异显著(P<0.05)；盐胁迫下高耐盐性材料的根冠比显著提高(P<0.05)，而盐敏感性材料则与对照差异不显著。

2.2.2 盐胁迫对不同耐盐性大麦形态特征的影响 由图2可知，不同耐盐大麦幼苗株高、根长、根表面积和根体积均受到盐胁迫的影响，盐敏感性材料ZDM222在NaCl 处理下，幼苗株高、根长、根表面积和根体积与对照相比急剧下降，受盐胁迫抑制作用明显，而高耐盐性材料ZDM655 的株高与对照相比显著下降(P<0.05)，根长则略有提高，而根表面积和根体积显著增大(P<0.05)，分别增加了26.97% 和6.34%，表现出对盐胁迫更具适应性的表型特征[18]。

图1 不同大麦材料耐盐性评价综合聚类Fig.1 Comprehensive cluster analysis of salt tolerance of different barley varieties

表6 NaCl处理下不同耐盐性大麦鲜重、干重、含水量和根冠比的比较

注：各指标均由平均值±标准误(SE)表示，每组数据3次重复(n=3)，用 Duncan’s 法统计各指标差异显著性，同一指标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。Note: The values are presented as means ± standard error (SE); n=3 for all groups. The bars represent the SE. Bars with the same letter are not significantly different at P<0.05 according to Duncan’s multiple range test, the same below.图2 盐胁迫下高耐盐性(ZDM655)、盐敏感性(ZDM222)大麦形态学指标比较Fig.2 Comparison of morphological indexes of highly salt tolerant barley (ZDM655) and salt sensitive barley (ZDM222) under salt stress

2.2.3 盐胁迫对不同耐盐性大麦Na+、K+积累的影响 在盐胁迫处理和对照植株中的Na+、K+含量测定结果如图3所示，与对照相比，200 mmol·L-1NaCl 培养显著提高了大麦植株中的Na+含量，但在高耐盐性材料ZDM655中Na+含量要低于盐敏感性材料ZDM222，ZDM655盐胁迫后地上部Na+含量是对照的3.64倍，而ZDM222地上部Na+含量是对照的8.95倍，上升幅度远高于ZDM655；ZDM655的根系中Na+含量是对照的2.55倍，而ZDM222地上部Na+含量是对照的2.92倍，增加幅度同样高于ZDM655。盐胁迫后高耐盐材料ZDM655对Na+的吸收量较少，从而保持了植株地上部较低的Na+水平[19]。

盐胁迫后高耐盐性材料ZDM655地上部K+含量与对照相比呈现出显著提高的趋势(P<0.05)，而根系K+含量呈现显著下降趋势(P<0.05)；与对照相比，盐敏感性材料ZDM222在盐胁迫处理后地上部K+含量显著下降(P<0.05)，根系K+含量与对照无显著差异[20]。由此可见，盐胁迫下高耐盐性材料根系吸收培养液K+，进一步运输到地上部，K+有效分配的能力要明显强于盐敏感性材料，进而促进了植株在盐胁迫下的正常生长。

图3 盐胁迫下高耐盐性(ZDM655)、盐敏感性(ZDM222)大麦Na+、K+分配特征比较Fig.3 Comparison of Na+ and K+ distribution between high salt tolerant ZDM655 and salt sensitive ZDM222 under salt stress in barley

3 讨论与结论

3.1 盐胁迫对大麦材料发芽期的影响

盐胁迫是大麦发芽期的重要影响因素，其结果通过许多数量性状指标来反映。Oyiga[21]、陈新[22]等研究发现NaCl 胁迫下对植物的根长和苗长有抑制作用，发芽势和发芽率与萌发期耐盐性关系密切；本实验中，大麦材料发芽期耐盐性存在明显差异，盐胁迫处理后各材料间种子发芽势、发芽率、株高、根长和根数较对比均下降并均达到了极显著差异水平。李先婷等[23]研究发现大麦耐盐机制存在很大差异，与对照相比，随着盐浓度的增高，地上生物量和株高受到抑制，根系生物量和根冠比增加。同时，高浓度盐分胁迫对根系的伸长和侧根的发育产生抑制作用[24]；苗期盐胁迫处理后，水稻在生长过程中叶片平均死亡率变幅增加，不同的生育期表现出特异性[25]。本研究发现，盐胁迫下，除株高和根长、发芽率无相关性以外，其它各指标之间均存在显著或极显著正相关。

3.2 大麦材料发芽期耐盐性综合评价

大麦群体材料发芽期耐盐性差异的多样性是耐盐种质材料筛选的重要基础。范娜等[26]研究高粱种质资源耐盐性，同样通过综合评价划分不同耐盐等级。本实验采用模糊隶属函数法对材料耐盐性进行综合分析，可将不同大麦材料划分为4个耐盐级别类型，其中类别I中包含高度耐盐性材料33份，类别II中包含中度耐盐性材料28份，类别III中包含中度盐敏感性材料16份，类别IV中包含盐敏感性材料49份。依据发芽势、发芽率、株高、根长和根数等指标综合评价大麦发芽期耐盐性，可以较为准确地对不同大麦材料的耐盐性程度划分等级，为大田生产提供一个参考选择。

3.3 大麦材料发芽期耐盐性生理响应特征

植物根系形态变化是决定根系水分、养分吸收范围和强度变化的重要参数。前人研究表明，发芽期耐盐性体现了种子吸水膨胀能力，其机理是苗期通过拒Na+来抵御渗透胁迫[27-28],小麦部分通过调节根系K+吸收系统而维持叶片较高的 K+/Na+比，从而提高其耐盐性[29]。在本实验中，耐盐性与盐敏感材料相比植株体内含有更少的Na+，说明耐盐性材料拒绝吸收Na+的作用更强；且耐盐材料在盐胁迫下地上部及根系中Na+积累较少，地上部K+积累水平较高，有效维持了植株体内离子的平衡，而盐敏感性材料调节植株体内离子平衡的能力较弱。岳小红[30]研究表明，不同类型盐分胁迫促进了啤酒大麦根表面积和根体积的增加，根冠比也增加。本实验研究发现，高耐盐性材料根表面积和根体积显著增大，表现出对盐胁迫的适应性更强；高耐盐性材料呈现出对盐胁迫更具适应性的表型特征，能够更有效提高根冠比，向根系分配更多的生物量，保持组织含水量。本实验不足之处就是未能测定盐胁迫下幼苗脯氨酸、叶片SOD、叶绿素等生理指标。

在盐渍化土地生产中，作物发芽期耐盐性强弱是生长的关键，大麦作为耐盐性较强的作物，遗传基础存在很大差异，盐分胁迫对大麦发芽期的生态指标均起抑制作用。而在苗期，由于不同种质耐盐性能力的不同，表现出不同的生理特征，高耐盐性材料通过减少对Na+吸收，增大根表面积和根体积等来提高耐盐性，具有更好的调节体内离子浓度平衡的能力；盐敏感性材料则相反。同时，采取综合评价可划分不同的耐盐等级和筛选高耐盐种质，为盐渍化土地利用开辟更多途径。