TGF-β1调控肺泡上皮细胞PI3K亚基构成变化的研究

董年 宋晨剑 董莉 陈成水

弥漫性肺泡损伤是肺损伤气血屏障破坏的重要病理特征，失控的炎症瀑布反应是肺泡损伤的关键环节[1-2]。异常的信号转导介导了失控的炎症瀑布反应，包括调节基团的表达突变和蛋白激酶的持续活化，其中异常磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号转导介导了肺损伤炎症瀑布反应中的核心信号流[3-4]。研究发现肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，AECs）在肺损伤炎症瀑布反应中扮演启动细胞和继发受体的角色[5]，探究肺损伤时AECs中信号转导的异常改变可以深入揭示肺损伤的发病机制。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是肺损伤时重要的炎症介质，结合之前研究发现TGF-β1可以活化AECs中的PI3K/Akt信号转导参与肺损伤炎症的起始和转归[6]，本文拟探讨TGF-β1是否可以调控PI3K亚基的构成变化，以进一步认识TGF-β1调控PI3K信号转导的分子机制。根据蛋白结构和底物特性PI3K家族包括ClassⅠ、Ⅱ和Ⅲ3类，具体包括Ⅰ型催化亚基（PIK3CA、PIK－3CB、PIK3CD 和 PIK3CG）、Ⅰ型调节亚基（PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5 和 PIK3R6）、Ⅱ型 PI3K 亚基（PIK3C2A、PIK3C2B和 PIK3C2G）和Ⅲ型 PI3K亚基（PIK3R4和PIK3C3）[7]。因此，明确PI3K家族在AECs中的表达情况和探究TGF-β1调控PI3K亚基的构成变化，有助于寻找潜在的肺损伤预测分子标志物和诊治分子靶点。

1 材料和方法

1.1 实验细胞 人AECs A549细胞株购于中科院上海细胞库。

1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基（规格：500ml，批号：8118021）、FBS（规格：500ml，批号：1739464）购自美国 Gibco 公司；人重组 TGF-β1（规格：5μg，批号：0212209）购自美国PeproTech公司；兔抗人PIK3CD单抗（规格：100μl，批号：34050S）购自美国 CST 公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（规格：2 500次，批号：RD231236）、预染蛋白 Marker（规格：250μl，批号：00557320）、ECL 发光液（规格：100ml，批号：QH220370A）购自美国 Thermo公司；Trizol（规格：100ml，批号：162912）购自美国Invitrogen公司；cDNA逆转录试剂盒（规格：200次，批号：AK2601）购自日本TAKARA公司；其他生化试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。实时定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 A549细胞株使用包含10%FBS和1%双抗的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.3.2 AECs中PI3K亚基mRNA表达水平检测 获取生长状态良好的A549细胞铺板，选取5ng/ml TGF-β1刺激 A549细胞，根据不同刺激时间（0、3、6、12、24和 48h）分组，收集各组细胞，按照Trizol说明书提取细胞总RNA，分光光度计法测定总RNA水平。取总RNA 2μg反转录为cDNA，再以适量cDNA为模板进行实时定量PCR法。实时定量PCR反应条件为 95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s，共 40个循环。结果以GAPDH为内参，对目的基因进行相对定量。

1.3.3 PIK3CD蛋白表达水平检测 采用Western blot法。提取各组细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白水平。每组取30μg蛋白进行凝胶电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭 2h，抗 PIK3CD 抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜10min 3次，抗兔抗体（1∶5 000）室温孵育1.5h，再用TBST缓冲液洗膜10min 3次，ECL化学发光法显影。以β-actin为内参，结果以各蛋白与β-actin灰度值比值表示。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AECs中PI3K亚基mRNA表达水平 AECs中Ⅰ型PI3K催化亚基以表达PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD为主，见图1。Ⅰ型PI3K调节亚基以表达PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3为主，见图2。Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基以表达PIK3R4、PIK3C3、PIK3C2A和PIK3C2B为主，见图3。

2.2 TGF-β1诱导PI3K亚基mRNA表达水平的变化TGF-β1可以诱导PIK3CD亚基mRNA的表达水平呈时间依赖性升高，与0h比较，12、24和48h的PIK3CD mRNA表达水平均升高，差异均有有统计学意义（均P＜0.05），其余PI3K亚基mRNA表达水平均无明显变化，见表2。根据PI3K亚基表达水平分析其在PI3K家族中的构成比，发现TGF-β1诱导的PIK3CD在Ⅰ型PI3K催化亚基的构成比呈时间依赖性升高，且在48h构成比最高。

图1 Ⅰ型PI3K催化亚基在AECs中的表达（PI3CG mRNA绝对表达量较低，图中未显示）

图2 Ⅰ型PI3K调节亚基在AECs中的表达（PIK3R5和PIK3R6 mRNA绝对表达量较低，图中未显示）

图3 Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基在AECs中的表达（PI3C2G mRNA绝对表达量较低，图中未显示）

表2 TGF-β1诱导PI3K亚基mRNA动态变化

2.3 TGF-β1诱导 PIK3CD蛋白表达水平的变化TGF-β1可以诱导PIK3CD蛋白表达呈时间依赖性升高，48h 最高，见图 4。

3 讨论

PI3K是一类机体内广泛存在的特异性磷酸化磷脂酰肌醇激酶，其介导的PI3K/Akt信号转导与免疫炎症、损伤修复和恶性转化病理生理过程密切相关[8]。PI3K家族中14种PI3K亚基任一的基因位点突变或蛋白异常表达皆可以导致异常活化的PI3K/Akt参与不同疾病的发生、发展。既往关于PI3K在肺部疾病中的研究多集中在肿瘤方面，突变的PIK3CA是肺癌驱动基因之一[9]，PIK3CA的突变导致PI3K/Akt信号转导的持续活化参与调控肿瘤的无限增殖和侵袭转移。近年来研究发现在肺损伤修复中同样存在持续活化的PI3K/Akt信号转导，其中肺泡上皮中持续活化的PI3K/Akt信号转导与炎性介质分泌、上皮间质转换和胞外基质分泌等密切相关[10-11]。考虑到PI3K亚基在肺损伤炎症起始转归中的重要角色，因此本文拟探讨AECs中PI3K亚基的表达情况和TGF-β1是否可以调控PI3K亚基的构成变化，期望以PI3K作为突破点为肺损伤发生、发展揭示新分子机制。

图4 TGF-β1对PIK3CD蛋白表达的影响（a：TGF-β1诱导PIK3CD蛋白表达的电泳图；b：TGF-β1诱导PIK3CD蛋白表达水平升高；与 0h 比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

针对AECs中PI3K亚基mRNA表达检测，本研究发现AECs中Ⅰ型PI3K催化亚基以表达PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD为主，Ⅰ型PI3K调节亚基以表达PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3为主，Ⅱ型PI3K亚基和Ⅲ型PI3K亚基以表达PIK3R4、PIK3C3、PIK3C2A和PIK3C2B为主。PI3K亚基包括催化和调节两个功能，协同发挥作用，参与PI3K信号转导的活化。已知TGF-β1是参与肺损伤修复重要的炎症介质，AECs的上皮间质转换、胞外基质分泌与TGF-β1活化的PI3K信号转导相关[12-13]，本研究深入探讨了TGF-β1是否可以调控PI3K亚基的构成变化。针对TGF-β1是否调控AECs中PI3K亚基构成变化，本研究发现 TGF-β1可以调控 AECs中PIK3CD催化亚基的表达，呈时间依赖性扩大PIK3CD在ClassⅠ型调节亚基中的比例。生理情况下PIK3CD在淋巴细胞中表达较为丰富，PIK3CD的突变或异常表达与B淋巴细胞非霍奇金淋巴瘤的发生密切相关[14]。Ge等[15]报道相较于正常对照，慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者气道平滑肌细胞（ASMs）存在PIK3CD的过高表达，过高表达PIK3CD与ASMs收缩蛋白的合成和炎症机制的释放相关。与此同时Mercado等[16]报道COPD患者血液单个核细胞中过高表达的PIK3CD与其糖皮质激素治疗的不敏感性密切相关。目前PIK3CD在肺部疾病发病中的作用处于起始阶段，PIK3CD经调控氧化应激、内质网应激和2型组蛋白去乙酰化酶等途径参与免疫调节、气道炎症和激素耐受等[11，17]，与肺部疾病的发生、发展密切相关。本研究发现TGF-β1可以诱导AECs中PIK3CD的表达，然而过高表达PIK3CD与TGF-β1活化PI3K/Akt信号转导过程之间的联系亟待阐明。考虑到催化亚基是PI3K的效应器，其表达水平与PI3K信号转导的持续活化密切相关[18]，肺泡上皮中过高表达的PIK3CD可能是一个潜在的肺损伤和纤维修复的药物干预靶点。

本研究在体外实验中探讨了TGF-β1调控AECs中PI3K亚基的构成变化，但存在些许不足：首先，选取的AECs是永生化的肿瘤细胞，虽然细胞模型具备认可度，但在原代细胞上验证结果可能更为可信；其次，尚未在体内实验中证实肺损伤修复中AECs PI3K亚基的构成变化，从而可以验证体外实验的结果。总之，本研究初步揭示TGF-β1调控AECs中PI3K亚基的构成变化，提示PIK3CD可能是未来肺损伤防治的潜在靶点，为今后PIK3CD在肺损伤中的作用研究打下了一定的基础。