Hippo信号通路在骨肉瘤中的研究进展

陈敬腾 方 硕 郭卫春

骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤之一，5年生存率仅60%～70%[1]。相比其他肉瘤，骨肉瘤对放射敏感度低，目前其主要的治疗方式是手术切除辅以化疗，但是伴有肺部转移的患者5年生存率亦不足20%，亟需寻找新的治疗方案[2]。近年来提倡以免疫疗法、基因疗法及靶向治疗与化疗结合的综合性治疗方案，而骨肉瘤基因存在着复杂的基因重组及拷贝基因变异，对其进行基因靶向治疗仍然是一项艰巨的任务[3,4]。

Hippo是一种进化上高度保守的信号转导通路，通过控制细胞增殖和凋亡起到调节器官大小和维持组织稳态的作用[5]。现已发现，Hippo信号通路可调控骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等恶性行为[6]。但关于Hippo信号通路在骨肉瘤中的研究较少，分子调控机制尚不清楚。本文综述了Hippo信号通路的组成、调节机制及骨肉瘤中Hippo信号通路分子变异情况，以期为骨肉瘤研究和防治提供更广阔的思路。

一、Hippo信号通路的概述

对Hippo信号通路的描述始于2003年果蝇hippo基因的发现， Pan和Hariharan实验室研究发现Hippo功能失活负性调控组织生长。随后，研究揭示Hippo信号通路是一种进化上高度保守的级联，由接头蛋白和调控Yorkie(促生长转录调节因子)的抑制性激酶组成[7]。哺乳动物中，Hippo信号通路将来自质膜和细胞质的信号传递到细胞核中，在核内调节多组不同靶基因的表达，从而控制细胞增殖、分化和凋亡。典型的Hippo信号转导通路包括哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2 (mammalian STE20-like protein kinase 1/2 ，MST1/2, 为果蝇Hippo同源物)、大肿瘤抑制基因1/2(large tumor suppressor 1/2，Lats1/2)，接头蛋白Salvador同源物1(Salvador homolog 1 ，SAV1)、Mob激酶活化剂1(Mob kinase activator 1 ，MOB1)、Yes-相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP，为Yorkie同源物)和具有PDZ结合基序的转录共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ binding motif ，TAZ，也称为含WW结构域的转录调节因子1，WW domain-containing transcription regulator 1, WWTR1)[7, 8]。Hippo信号通路打开时， MST1/2 激酶发生磷酸化以激活Lats1/2 激酶，活化的Lats1/2在Sav1 的辅助下激活MOB1，继而Lats1/2的PPxY(PY)基序与YAP/TAZ的WW结构域之间相互作用使YAP/TAZ磷酸化，磷酸化的YAP /TAZ 与14-3-3 结合后滞留在细胞质中，被β-含有E3泛素转导重复蛋白连接酶(β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，β-TRCP)依赖性蛋白酶体降解，失去转录共激活作用。当Hippo信号通路关闭时，YAP/TAZ转移至细胞核，与TEA-含有特异性序列转录因子(TEA domain-containing sequence-specific transcription factors，TEADs)以及其他转录因子形成复合物，激活下游靶基因，促进肿瘤形成[8, 9]。

二、Hippo信号通路的调节机制

笔者对Hippo信号通路的理解大部分来自于在上皮组织中进行的研究， 其中YAP/TAZ的转录活性受4个相互关联的信号调节：①质膜蛋白，它可以直接与YAP/TAZ直接复合，从而在细胞-细胞连接处阻断质膜信号；②上游接头蛋白，它可以激活Hippo核心激酶，最终磷酸化YAP/TAZ以抑制其活性；③其他信号通路的交叉串扰调节；④作用于细胞的机械力，它可以局部控制YAP/TAZ定位。

1.质膜蛋白：当细胞密度增加到一定程度时，生长调控信号通过质膜蛋白传递到上游Hippo蛋白，进而启动下游一系列细胞因子表达以调节细胞增殖。目前，研究较多的质膜蛋白有Crumbs极性复合物、G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCR)、CD44以及非典型钙黏蛋白Fat。Crumbs极性复合物是一种跨膜蛋白，招募位于顶端区域的支架蛋白介导细胞极性，它与其他极性蛋白质和黏附蛋白之间即相互作用，又为Hippo组件提供上游信号输入因子[10]。GPCR被认为是一种调节Hippo信号转导通路的质膜蛋白，YAP/TAZ 受到众多分泌信号和相关GPCR 的调控，从而将Hippo 信号通路与更多胞外信号联系起来，发挥更多的生理功能[11]。跨膜透明质酸受体CD44在Hippo通路中起到重要作用，它与神经纤维蛋白2(neurofibromin2，NF2，也称为Merlin)和其他支架蛋白相互作用，募集Lats到细胞膜并在那里磷酸化[12]。非典型钙黏蛋白Fat能促进FRMD6扩增并定位到顶端连接，导致MST1/2的激活[13]。

2.上游接头蛋白：Hippo通路的核心元件受上游复杂的调控网络控制。MST和Lats激酶的活性受多种上游蛋白调节，包括含Ras-相关结构域家族蛋白(Ras-association domain containing family proteins，RASSFs1-10)，肾和脑蛋白(kidney and brain protein，KIBRA)，一千零一个氨基酸蛋白1(thousand and one amino acid protein 1，TAO-1)，MAP/微管亲和调节激酶1(microtubule affinity-regulating kinase 1， MARK1)和NF2[14]。RASSFs和SAV1通过与SARAH(SAlvador-RAssf-Hpo)结合域相互作用调节MST活性，之后MST1/2与SAV1形成复合物以磷酸化Lats1/2；MAT1/2-SAV1复合物也可以结合MOB1使MOB1磷酸化，磷酸化的MOB1结合Lats1/2使其发生自我磷酸化[15]。目前已经有越来越多的研究来探讨上游蛋白和Hippo激酶之间的相互作用，但它们结合到何种程度还取决于组织类型、细胞环境以及它们对典型Hippo信号通路的依赖性，这仍需要进一步的研究。

Hippo信号通路在细胞接触抑制、细胞增殖和促进细胞凋亡中起重要作用。随着细胞汇合增加，肿瘤抑制因子NF2定位在细胞连接处的附近以激活Hippo信号，研究表明抑制YAP可以抑制间皮瘤和脑膜瘤中NF2失活引起癌细胞的过度增殖；另外，敲除肝脏特异性NF2的小鼠中过表达显示阴性的TEAD能够抑制肿瘤生长[16]。YAP/TAZ和Lats2之间存在着负反馈回路，YAP/TAZ和TEAD复合后通过NF2诱导Lats2表达，同时Lats2可以通过AMOT磷酸化抑制YAP/TAZ活性。另外，YAP和TAZ之间也可能存在着负性调节，有研究表明，YAP敲除的小鼠中TAZ富集，而体外抑制或过表达YAP会导致TAZ蛋白表达的反向变化[17]。

3.信号通路间的交叉串扰:细胞、器官、组织的状态和功能由一个多信号通路组成的形态发生信号整合网络调控，有研究者发现Hippo转导通路是这个整合网络的枢纽[9]。虽然肉瘤中通路间交叉串扰仍需要进一步探讨，但是已有研究证明这个网络中许多通路可以单独引起肉瘤发生。YAP/TAZ已经被公认为是众多信号级联的共转录激活因子。然而，目前人们对交叉串扰调节方式的认识还处于初步阶段，Hippo信号通路与其他通路间是通过协同作用还是拮抗作用来调节生物活动的还需要进一步研究。

Wnt通路与Hippo通路之间存在着相互作用以调节细胞功能。Rosenbluh等在85个癌细胞系(包括骨肉瘤)中进行全基因组规模的功能丧失筛选，发现肿瘤Wnt活化依赖于β-catenin和转录因子TBX5。β-catenin来源的原位结肠癌小鼠模型中β-catenin与YAP形成复合物参与肿瘤形成[18]。Heallen等[19]发现敲除小鼠心肌细胞Hippo组件中的Sav1，MST1/2或Lats2后YAP活性增加，且心肌细胞增殖增强。对这些小鼠进行基因谱分析发现Wnt活性增强，而条件性缺失β-catenin一条等位基因后心肌细胞功能受到抑制,证实了Wnt与Hippo通路间的相互作用。TGF-β和Hippo信号通过协同作用指导细胞行为。YAP/TAZ与SMADs相互作用以促进TGF-β和BMP靶基因的转录，TGF-β信号转导可以调节YAP/TAZ表达以驱动间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)分化[20]。Hong等用BMP2处理MSC，发现 TAZ表达增加，其与Runx2的相互作用也增强以促进成骨细胞分化。Notch与Hippo信号转导间的也存在着协同作用的“交叉串扰”。Notch已被证明是骨和软组织肉瘤的驱动因素[21]。在YAP/TAZ机械依赖性调节信号转变为Notch信号转导调节的过程中，YAP/TAZ将来自细胞外基质的物理刺激转化为细胞-细胞间信号级联，继而控制细胞增殖、凋亡、分化等[22]。综上，在调节细胞生物学和恶性肿瘤方面，这些见解为研究Hippo信号通路提供了更深入的认识。

4.机械力因素:细胞在发挥维持体内稳态，促进器官发育的功能时，必须及时感知微环境变化且对变化做出相应改变，除了传输生物化学信号外，细胞还可以从机械力信号中提取信息。在细胞水平，机械力转导是通过感知物理刺激(细胞外基质的弹力和细胞-细胞或细胞-基质相互作用产生的力)将其转化为生物信号，细胞通过快速支架重塑来适应这种物理刺激，将支架重塑与细胞生物行为变化联系起来的动态因子即YAP和TAZ[23]。因此，机械力刺激可以通过调节YAP/TAZ活性调节细胞命运，并决定干细胞维持、增殖和分化。

在高机械应力和低细胞接触的情况下，YAP/TAZ转录活跃，而致细胞增殖及组织生长；随着细胞接触增加，黏附分子激活Lats，导致YAP/TAZ磷酸化而无法进入细胞核发挥转录作用[9]。F-肌动蛋白聚合和应力纤维形成均可使YAP/TAZ定位于核内而活化，而破坏F-肌动蛋白则抑制YAP/TAZ转录活性。细胞外基质硬度以及细胞形状可以控制Rho-GTP酶的活性及应力纤维和肌动蛋白束的形成来调节YAP/TAZ定位；而当培养于高硬度细胞外基质或被制成“伸展”形态时，YAP和TAZ在核内活化且MSC分化成成骨细胞[24]。可见YAP和TAZ充当这机械力转导的感受器和细胞对机械信号响应的介质，YAP/TAZ的这种机械力因素取代了来自细胞-细胞或细胞-基质的接触因素。

三、骨肉瘤Hippo信号通路变异

1.YAP:人类组织芯片分析证实骨肉瘤中YAP1表达量高于周围非肿瘤组织，并且表达量与肿瘤级别相关，78%的人类骨肉瘤样本中YAP1高表达，同时靶基因表达量也增多[25]。体外实验中，抑制YAP表达后细胞增殖及细胞侵袭能力降低，Runx3、CyclinD1和MMP-9的表达量也降低；动物实验中，抑制小鼠异种移植骨肉瘤或转基因小鼠成瘤模型的YAP活性后肿瘤生长被抑制[26]。

骨肉瘤中YAP上调的机制复杂，其中干细胞转录因子Sox2起着重要作用。在小鼠骨肉瘤细胞系中，Sox2直接抑制Hippo通路激活剂NF2和Kibra,导致YAP高表达，细胞继续培养成为干细胞富集的骨肉瘤球后，YAP表达量则更高(而NF2表达量更低)。在敲除Sox2基因的细胞中，无论是Yap过度表达还是NF2抑制都能促使骨肉瘤球形成；而抑制YAP或者高表达NF2却促进成骨分化并抑制骨肉瘤球形成。过表达野生型YAP或活化重组突变型YAP能够抑制NF2诱导的骨肉瘤细胞分化表型，而缺乏TEAD结合位点的突变型YAP没有此作用。Sox2通过经典Hippo信号转导途径调节YAP活性，抑制MST1/2或Lats1/2消除了NF2诱导的成骨分化作用，YAP的表达和功能也发生变化[27]。

YAP上调也可受Hedgehog通路调节。Ptch1c/+、p53+/-、HOC-Cre突变小鼠中恶性骨肉瘤具有高外显率，在p53杂合背景下Hedgehog信号部分上调，并且所得肿瘤中YAP1高表达，而在抑制Hedgehog信号后YAP1表达又显著降低，YAP1所引起的肿瘤进展也被抑制。Chan等[28]也表明Hh-YAP轴可能通过调节LncRNA-H19的表达导致肿瘤发生。

2.RASSFs：现已证明RASSF5与RASSF10是骨肉瘤的肿瘤抑制因子，类似于RASSF家族中其他成员，在人类肿瘤(包括骨肉瘤)CpG岛启动子超甲基化作用下RASSF5和RASSF10下调。在一份载有45例骨肉瘤样本的组织芯片数据中，RASSF5显著下调，其表达量与肿瘤远处转移呈负相关。体外实验中，抑制U2OS细胞RASSF5表达，则MST1促凋亡功能失活，从而抵抗TNF-α诱导的细胞凋亡；相反地，高表达骨肉瘤细胞系中的RASSF5，细胞的增殖能力和侵袭能力减弱，而细胞凋亡增强[29]。

3.NF2：人类生殖细胞或体细胞中NF2的一个等位基因突变将会导致2型神经纤维瘤病发生，该突变与神经鞘瘤，脑膜瘤和室管膜瘤也有相关性。NF2杂合的小鼠具有高致瘤率，能导致多种恶性肿瘤发生，其中骨肉瘤发生率为63%。而在这些肿瘤体细胞内野生型NF2等位基因均存在突变，也就意味着NF2杂合性的丧失可能导致肉瘤生成。

4.CD44：CD44是一种细胞表面糖蛋白，可将细胞外信号传递给ERK，AKT和Hippo通路。研究发现，异种移植小鼠中降低CD44表达可以观察到骨肉瘤恶性表型增强，但在体外实验中，发现CD44被NF2抑制后会导致骨肉瘤细胞系迁移和侵袭能力减弱。Hartmann等表明NF2与CD44复合后通过ECM信号介导接触生长抑制。

5.MOB1：在体外实验中，MOB1A高表达会降低细胞增殖能力，而抑制MOB1A表达将导致异常有丝分裂。在缺失MOB1A和MOB1B的双突变小鼠中，两个等位基因完全丧失(MOB1AΔ/Δ1Btr/tr，MOB1A无效突变，MOB1B基因陷阱)会导致胚胎死亡。然而，保留任一个等位基因(MOB1AΔ/ +1Btr /tr或MOB1AΔ/Δ1Btr/ +)的双突变小鼠可在70周内存活，并且100%能自发形成肿瘤。24%的小鼠(9/37)出现骨外骨肉瘤，而92%小鼠(34/37)出现良性外生骨疣。检测单个杂合子(MOB1AΔ/ +1Btr /tr或MOB1AΔ/Δ1Btr/ +)组中，发现所有肿瘤都显示野生型MOB1等位基因缺失，表明杂合性缺失可能是肿瘤生长所必需的。

四、展 望

Hippo信号通路是一种进化上保守的肿瘤抑制网络，不仅对正常的细胞、组织和器官的发育，体内平衡和修复有重要作用，在许多癌症中也发现它调控异常。目前，上游核心Hippo通路成员、接头蛋白的遗传和表观遗传失调已经被注意到，Hippo信号在正常和癌性间充质细胞行为和命运的机械转导中的作用提供了对肉瘤生物学的更多见解。Hippo通路中单个基因的突变会造成通路调节的失调进而促进肿瘤的发生，但其在骨肉瘤中发生、发展机制尚不清楚，需要进一步的研究来阐明特定肉瘤亚型中Hippo途径失调的潜在机制，为成功开发治疗干预骨肉瘤提供基础。