CD22-CD19-CAR-T细胞治疗儿童难治性复发性B淋巴细胞白血病的研究进展

孙柏青 张 莹 张 静 张丽坤 曹峰林

B-ALL患儿化疗后缓解率达到95%以上，虽然化疗是儿童难治性复发性B淋巴细胞白血病首选治疗方法，但尚有部分患者对化疗无效或化疗后复发，所以难治性和复发性患者的治疗效果仍然是个挑战[1]。迫切需要用于改善难治性复发性结果的新型方法，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)被用于患有难治性复发性的儿童急性淋巴细胞白血病患者，其中CD19靶向的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T(CAR-T)细胞免疫疗法已经在儿童难治性复发性白血病中显示出令人印象深刻的结果，缓解率为70%～90%，但仍会引起一部分患者在CD19-CAR-T细胞治疗后复发[2]。同时细胞因子释放综合征(cytokine-release-syndrome，CRS)和神经毒性在一部分患者中可能危及生命。为降低复发率并治疗那些CAR-T细胞治疗后患有抗原丢失的复发患者，顺序输注CD22-CD19-CAR-T细胞运用于临床治疗，即使产生了适度的CRS,但尚未观察到神经毒性的证据及复发。白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)受体拮抗剂和类固醇类激素已被用于控制这些毒性，使得CD22-CD19-CAR-T细胞能够在没有明显功效损害的情况下使用。

一、CAR-T细胞结构与特点

1.CAR-T细胞制备及优势：CAR-T细胞是CAR杂合受体，CAR是一种合成蛋白，经基因工程改造后可在T细胞表面表达。它包含细胞外结合结构域、铰链区、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号转导结构域[3]。由于嵌合性质，使用基因转移技术(例如慢病毒或反转录病毒载体)重新编程患者的T细胞以表达CAR，CAR具有以独立于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的方式将T细胞通过非MHC限制性识别特定抗原能力，从而增强识别与杀伤肿瘤细胞的能力[4]。CAR-T是患者自身的T细胞，其在体外重新设计以表达嵌合抗原受体(CAR)，使其能够识别在白血病细胞表面上表达的一种抗原。在临床环境中，CAR-T被激活，进行基因改造，扩增，然后再输注回到患者身上，以便重建永久性的抗肿瘤免疫系统。作为一种“活的药物”，不仅不会被代谢掉，还会在患者体内复制、迁移、增殖和杀死表达同源抗原的靶细胞，通过强大的体外扩增能力形成记忆细胞，一次输注体内存续时间久，针对低表达量的靶分子仍然有效等[5]。

2.CAR-T细胞结构：CAR-T细胞结合了靶标识别中的抗体和效应物的强烈特征，并且T细胞和效应细胞的长期功能直接被带入肿瘤细胞。CAR-T细胞是由3个结构域组成的人工受体：①来自抗体单链可变片段(scFv)的细胞外抗原特异性结合结构域；②通常来源于CD8α的铰链和跨膜区段或IgG结构域；③细胞内T细胞信号转导结构域。CAR-T细胞经基因工程改造以通过病毒(反转录病毒、慢病毒、腺病毒)或非病毒技术(例如电穿孔、基于转座子或基因编辑系统)表达CAR。

3.CAR-T细胞结构演变及特点：通过对胞内信号区设计的改造，CAR经历了从第1代到第4代的变迁。第1代CAR仅含有来自TCR/CD3受体复合物的基于酪氨酸的zeta信号转导亚基，与该zeta结构域相邻，但增殖效应小、释放细胞因子少，导致抗肿瘤细胞效应不足。在第2代和第3代CAR中向细胞内结构域添加共刺激信号，旨在改善工程化T细胞的存活。第2代CAR含有一个额外的共刺激分子，在治疗血液肿瘤方面应用广泛。第3代CAR含有两个额外的共刺激分子，或诱导型T细胞共刺激分子，使得持续性更强。第4代CAR增加了编码CAR与其反应性的启动子载体，可以在激活时表达调节抗肿瘤微环境的细胞因子进而招募并活化更多的免疫细胞攻击肿瘤细胞, 并通过调节肿瘤微环境从而增强免疫反应。

二、CAR-T毒性不良反应与治疗

1.脱靶效应：由于CAR-T细胞所针对的肿瘤细胞相关抗原在正常组织中存在不同程度的表达，所以在对靶细胞有抗原亲和力和杀伤力的CAR-T细胞同时也会攻击正常组织细胞，从而造成正常组织与器官的损伤。通过导入自杀基因、构建抑制性CAR-T细胞及双靶抗原CAR-T细胞可改善脱靶效应。

2.CRS：通常发生于CAR-T细胞输注后2～3周内，与CAR-T细胞回输剂量无关，患者体内常存在高水平的IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-2、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、单核细胞趋化蛋白1(human monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、可溶性gp120等细胞因子及肿瘤负荷，同时粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一种关键的CRS促进蛋白，与CRS水平呈正相关[6]。临床可通过血清GM-CSF、血清C反应蛋白和铁蛋白水平监测。常见的表现形式包括发热、寒战、低血压、呼吸困难及脏器功能异常，通常可通过解热、升血压、吸氧、水化、碱化等对症处理，因类固醇类激素影响CAR-T细胞增殖，而常常将IL-6受体拮抗剂作为一线治疗方案。必要时可通过敲除CAR-T细胞中GM-CSF基因或通过导入自杀基因等途径清除体内过多的活化CAR-T细胞控制CRS。

3.神经系统损伤：研究表明，血-脑脊液屏障和星形胶质细胞功能障碍的破坏与神经系统损伤的发展有关，常由于预处理方案药物、CAR-T细胞穿透血-脑脊液屏障、较高的CAR-T细胞峰值等引起，常伴随早期或者严重CRS反应，临床症状表现为意识不清、抽搐、共济失调等中枢系统症状[7，8]。CAR-T细胞输注前的炎性反应、内皮功能障碍/激活、峰值CAR-T细胞、细胞因子水平、内皮激活的生物学标志及CSF蛋白水平增加了严重的神经系统损伤的风险。治疗神经系统损伤需针对细胞因子、单核细胞、内皮细胞及血-脑脊液屏障进行干预[6]。虽然IL-6受体拮抗剂和高剂量类固醇类激素通常可有效控制CRS，但IL-6在逆转神经毒性方面效果较差, 需通过利用类固醇类激素穿透血-脑脊液屏障的作用而应用于治疗神经系统损伤[9，10]。达沙替尼通过可逆地抑制CAR-T细胞的细胞毒性、细胞因子分泌和增殖，且通过穿透血-脑脊液屏障作用，可用于减轻神经系统损伤。

4.移植物抗宿主病：除CAR-T细胞来源于患者本人，而其他非来源于患者本人的非同源CAR-T细胞易引移植物抗宿主病，虽然通过敲除技术可降低移植物抗宿主病风险，但同时存在CAR-T细胞活性降低的风险。虽然脐带血为非同源制备CAR-T细胞来源，但脐带血中自然杀伤细胞通过直接杀死肿瘤细胞，可减少移植物抗宿主病风险。

5.噬血性淋巴组织细胞增多症(fulminanthaemophagocytic lympho histiocytosis，HLH):其特征是巨噬细胞和淋巴细胞过度活化，促炎细胞因子产生，淋巴组织细胞组织浸润，作为CRS严重时表现，患者通常有基因易感性，临床表现为骨髓可见噬血细胞、外周血细胞计数降低、凝血功能障碍及高热等。应用托珠单抗或类固醇激素可控制良好。如果患者在48h内没有临床或血清学改善，应考虑使用依托普利的额外治疗。在不久的将来，在HLH中发挥核心作用的特异性细胞因子将会发生重要作用[6]。

6.B细胞缺如：因CD22-CD19-CAR-T细胞靶向于B细胞表面表达的靶点，可引起B细胞发育不良，导致B细胞缺如。由于CAR-T细胞不会像药物被代谢掉，还会在体内形成记忆细胞，持续长时间存在，所以B细胞缺如的情况就难以改善。因此，B细胞缺如可作为功能性CAR-T细胞持久性的药效学标志物[11]。

7.低丙种球蛋白血症：B细胞缺如会造成严重的低丙种球蛋白血症，需要静脉注射免疫球蛋白。CD22-CD19-CAR-T细胞引起的长期B细胞缺如，需输注免疫球蛋白纠正，且仅能补充IgG。

8.感染综合征：CAR-T治疗后的大多数感染发生在中性粒细胞减少症和(或)严重CRS之后，对抗菌治疗反应差，反映了感染相关细胞因子的扩增和抗细胞因子治疗对免疫的影响及更高程度的免疫功能障碍。也可能与先前的自体或同种异体造血细胞移植、预处理方案有关，其机制与持续的细胞免疫缺陷有关。先前存在的血细胞减少和低丙种球蛋白血症及CRS可能导致感染异常严重。80%的首次感染是在CAR-T输注后的前10天内，42%在输注后的前30天内发生细菌、真菌或病毒感染。超过30天，病毒感染占主导地位，晚期感染可能反映长期免疫球蛋白缺乏以及淋巴细胞减少症。预防感染综合征应在调节和输注CAR-T产品之前控制活动性感染，特别是在CRS引起的炎性过程恶化的情况下[12]。

9.恶性肿瘤：反转录病毒和慢病毒基因转移系统是CAR-T细胞疗法的遗传修饰中最常用的载体。衍生自这些病毒家族的载体具有两种潜在风险：产生复制型病毒和插入诱变，特别是致癌活化。使用γ-反转录病毒和慢病毒修饰CAR-T细胞进行的许多临床试验尚未证实CAR-T细胞中的插入突变[13]。虽然风险似乎非常低，但是继发性恶性肿瘤的临床监测和CAR-T治疗后的长期随访应继续成为临床试验方案的一部分，需进行前瞻性、多中心、观察性研究，以评估长期安全性以及治疗后发生继发性恶性肿瘤的风险[14]。

三、CD22-CD19-CAR-T细胞特点

1.CD19-CAR-T细胞治疗后复发特点及对策：(1)CD19特异性表达于正常B细胞、 B细胞前体细胞，不表达于造血干细胞及非造血细胞，作为一个理想的治疗靶点，CD19-CAR-T细胞的治疗使得ALL患者获得了较好的完全缓解率(complete response,CR)，但复发仍然存在，其中CD19阴性复发最常见[15]。CD19抗原的表达缺失导致的CD19免疫逃逸是CD19-CAR治疗B-ALL后最常见的复发原因，其主要机制是:①CD19基因突变或缺失导致合成障碍；②参与CD19合成的相关转录因子缺陷；③白血病细胞发生类型的转变,CD19-阴性白血病亚群引起明显的骨髓复发；④治疗之前存在不同水平的CD19阴性白血病克隆，而在CD19-CAR-T细胞治疗中因不表达CD19抗原而逃避杀伤作用。另一个导致CD19阴性复发原因可能是:在CAR-T细胞治疗后，由于CD19阳性细胞被杀灭,导致CD19阴性细胞大量增殖而导致白血病复发[16]。所以CAR-T治疗后微小残留白血病(minimal residual disease，MRD)的监测不应该局限于CD19阳性细胞，监测CD19阴性细胞细胞的免疫表型变化也尤为重要。对于CD19阴性复发，重新输注将没有用，因为B-ALL不再表达目标[15]。(2)CD19阳性复发中，多因T细胞功能较差或早期输注CAR-T细胞后CAR-T细胞消失导致，其中较为罕见的原因是谱系转化，另一个原因可能与CAR-T细胞内的共刺激结构域有关[17]。这些患者中，重新输注CAR-T细胞可能会有所帮助。

2.CD19-CAR-T细胞治疗后复发对策：(1)对于CD19阳性复发患者，CD19-CAR-T细胞经过共刺激信号分子改造后，可实现CAR-T细胞扩增。(2)而对于CD19阴性患者采用多种标志物的共靶向CAR-T治疗，CD19不是CAR-T细胞的独特有效靶标，CD22表达于大多数B细胞性急性淋巴细胞白血病患者，包括在CD19定向免疫疗法后发展CD19免疫逃逸的大多数患者保留CD22表面表达，并且白血病仍然对免疫治疗敏感。(3)同种异体移植治疗，造血干细胞移植是目前唯一可以治愈B-ALL的方法，在患者获得完全缓解后桥接造血干细胞移植。

3.CD22-CAR-T细胞治疗特点：(1)CD22也在大多数B-ALL病例中表达，并且通常在CD19丧失后保留。Fry等[15]的临床试验表明，在接受CD22-CD19-CAR-T细胞治疗的患者中，有73%(11/15)获得完全缓解，包括CD19阴性复发的5例患者。(2)CD22-CAR-T细胞具有与CD19-CAR-T细胞相似的安全性，且双抗原的免疫治疗，可以减少肿瘤通过抗原丢失逃逸的可能性。ChiCTR(Chinese Clinical Trial Registry, number ChiCTR-OPN-16008526)临床试验表明50例患者接受CD22-CD19-CAR-T细胞治疗后，有48例(96%)在第30天评估时达到CR，其中94% MRD阴性，所有B-ALL患者的无进展生存期(progression-free survival,PFS)为12.0个月[18]。(3)数据证明了CD22-CD19-CAR-T细胞产生了有效的抗白血病活性，即使产生了适度的CRS，但在CD22-CD19-CAR-T细胞治疗后没有显示脱靶毒性的证据。(4)CD22-CART细胞也有效迁移至脑脊液，但尚未未观察到严重神经毒性或癫痫发作的证据[19，20]。(5)同时靶向B-ALL表面上的两种抗原可降低抗原丢失变体的可能性。

4.CD22-CD19-CAR-T细胞治疗后复发及复发后对策：(1)Fry等的临床试验表明，在CD22-CAR-T细胞治疗缓解后复发的8例患者中发现有7例患者存在CD22位点密度降低，这与潜在的细胞遗传学亚型有关，可能使CD22+细胞逃脱CD22-CART细胞的杀伤。(2)在达到CR的12例患者中，有8例患者在输注CD22-CAR-T细胞后1.5～12.0个月(中位数6个月)复发，并且有7例患者发现CD22表面表达减少，而不是表面表达的完全丧失，足以使CD22定向的CAR治疗中的白血病逃逸[15]。(3)实际上，B-ALL上CD19和CD22的表达水平在患者与患者之间可能是异质的，复发时可能发生免疫表型改变，特别是在靶向治疗时代。因此，CAR-T细胞的双重靶向可以是更广泛的活性疗法，其可以解释抗原表达的基线变异性和随时间发生的变化。采用多种抗原免疫治疗及同种异体移植可减少抗原丢失逃逸带来的复发。(4)在先前CD19和CD22定向治疗失败的患者中，应尽早考虑造血干细胞移植而不是等到复发[15，18]。

四、展 望

因造血干细胞移植依赖于寻找MHC匹配供体的能力以及避免可能危及生命的感染和移植物抗宿主病等并发症等特点，且CAR-T细胞治疗B-ALL可获得分子学缓解，有完善的治疗方案应对CAR-T细胞治疗后所产生的不良反应，CD19和CD22双靶抗原治疗解决了CD19治疗后复发的部分问题[21]。因此，CAR-T细胞的双重靶向可以是更广泛的活性疗法，其可以解释抗原表达的基线变异性和随时间发生的变化。最后，双靶向B-ALL表面上的两种抗原可降低抗原丢失变体的可能性，已经进入临床实践，取得了满意的疗效，有望成为B-ALL复发的新方案。