分子印迹技术在中药研究中的应用

徐 硕，邝咏梅，吴学军，姜文清，金鹏飞

(北京医院药学部，国家老年医学中心，药物临床风险与个体化应用评价北京市重点实验室，北京 100730)

分子印迹技术(molecularly imprinting technology，MIT)是指将某一特定的目标分子(也称为模板分子、印迹分子或烙印分子)作为模板，制备对该分子具有特异选择性聚合物的过程，常被描述为制造识别分子钥匙的人工锁的技术。该技术具备特异识别性和构效预定性等优势，分子印迹聚合物的吸附性良好、选择性高，在目标药物的识别、富集、分离和检测中被广泛应用[1]。本文综述了近年来分子印迹技术在中药研究方面的应用，以期为该技术在中药领域中的推广应用提供参考。

1 概述

1.1分子印迹技术的基本原理 在聚合物单体溶液中，模板分子(印迹分子和目标分子)依靠交联剂的作用与功能单体进行聚合，得到模板分子-单体的聚合物，之后通过物理或化学方法洗去模板分子，即得到分子印迹聚合物，该聚合物印迹有模板分子空间结构和结合位点，对模板分子具有特异选择性[2]。

1.2分子印迹聚合物的制备 制备过程分为3步：①主客体配合物的形成：通过官能团之间的共价、非共价或半共价作用，使得模板分子与功能单体形成配合物；②聚合反应的产生：通过加入交联剂和致孔剂使其产生反应；③将聚合物中的模板分子洗掉。按照上述方法制得的分子印迹聚合物有选择性，与模板分子大小、形状相匹配的立体孔穴可以在聚合物中留下。由于聚合方法和形式的不同，能够制得不同形态的聚合物。分子印迹技术按照模板分子和功能单体间的相互作用分为非共价法、共价法和半共价法。目前可采用本体聚合、悬浮聚合、乳液聚合、沉淀聚合以及表面印迹法等方式[2-4]。

2 分子印迹技术在中药研究领域的应用

2.1在中药有效成分提取分离纯化中的应用 中药的化学成分复杂，采用正相或反相硅胶、大孔吸附树脂和凝胶柱色谱等常用的柱色谱技术，或结合制备或半制备液相色谱等技术进行化学成分的提取、分离和纯化效率普遍较低。而采用分子印迹技术可以明显缩短实验周期，快速分离纯化得到目标化合物。

2.1.1用于黄酮类化合物的分离 黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和预防心血管疾病等多种生物活性，药用开发价值很高[5-6]。Yang W L等[7]制备柚皮苷印迹聚合物是利用柚皮苷作为模板分子，测试结果表明，该聚合物的最大平衡吸附量是64.80 μmol·g-1，可以使柚皮苷很快吸附。把该印迹聚合物作为固相萃取吸附剂，有助于从橘红中提取并富集得到柚皮苷，经检测该化合物的质量分数为72%。Pakade V等[8]制备了槲皮素印迹聚合物，用此聚合物制备固相萃取柱，从辣木的甲醇提取物中分离得到槲皮素与山柰酚2种黄酮苷元。姚杰等[9]采用高良姜素作为模板分子，制备对模板分子具备特异性吸附和识别能力的高良姜素分子印迹聚合物，成功应用于药材中活性成分高良姜素的分离纯化。潘浪胜等[10]为分离花生壳中的黄酮类成分，利用木犀草素为模板分子，制备分子印迹聚合物，结合柱色谱技术，从花生壳体积分数为70%的乙醇提取物中成功分离得到木犀草素，并经氢谱、碳谱和质谱等技术鉴定其结构。

2.1.2用于蒽醌类化合物的分离 王胜利等[11]利用热引发聚合制备大黄酚分子印迹聚合物，大黄酚作为印迹分子，4-乙烯基吡啶作功能单体，聚合物对大黄酚的选择性能测试是通过固相萃取柱来进行。结果表明，该印迹聚合物对模板分子具备良好的选择性及识别能力，使得大黄酚和大黄素甲醚在固相萃取柱上分离良好，大黄酚被富集了23倍。

2.1.3用于二萜类化合物的分离 乐康等[12]将α-甲基丙烯酸作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联剂，丹参酮ⅡA为模板分子，采用热聚合法制得对丹参酮ⅡA具备特异选择性吸附的分子印迹聚合物。该聚合物的识别性能检测依据平衡结合实验和固相萃取实验进行评价，结果显示，其对丹参酮ⅡA具备很好的识别性能，能达到从丹参酮提取液中分离得到该目标成分的目的。

2.1.4用于三萜类化合物的分离 倪付勇等[13]将分子模板确定为去氢土莫酸，通过溶胶-凝胶法制得该化合物的分子印迹聚合物，并对其吸附性能进行研究。以此聚合物为填料，从桂枝茯苓胶囊提取物中进一步分离制得去氢土莫酸。经Scatchard分析，去氢土莫酸分子印迹聚合物最大表观结合位点数(Qmax)是9.10 mg·g-1。经HPLC法检测去氢土莫酸质量分数为90.76%。该方法能用于从桂枝茯苓胶囊提取物中靶向分离制备去氢土莫酸，减少提取过程中有机溶剂的使用。

2.1.5用于生物碱类化合物的分离 Suedee R等[14]以奎宁作为模版分子合成印迹聚合物，将合成的分子印迹聚合物用于薄层色谱，结果表明，该聚合物可很好地识别奎宁分子对映体及与其结构相似的化合物。奎宁在稀硫酸溶液中能产生荧光，卢彦兵等[15]利用荧光法对奎宁分子印迹聚合物(MIP)的吸附性能和识别能力进行探索，测试结果显示其离解常数为1.08×10-3mol·L-1，表观最大吸附量为131.8 μmol·g-1，为中药中奎宁的选择性富集及分析提供了新途径。Lai J P等[16]采用苦参碱作为模板制备分子印迹膜，从槐属植物苦参中分离得到苦参碱，测定了分子印迹膜对该成分的回收率(71.4%)，为药材中有效成分的大量提取奠定基础。

2.1.6用于鞣质类的分离 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有良好的抗氧化、抗肿瘤和降血脂等药理作用，该化合物可从中国绿茶中分离得到。雷启福等[17]采用本体聚合法，对EGCG分子印迹聚合物进行合成，通过固相萃取来分离纯化茶叶提取物中的EGCG，进而分离得到高纯度的EGCG。钟世安等[18]利用EGCG作为模板分子合成了分子印迹聚合物，将该聚合物制成分子印迹固相萃取柱，用于茶叶中有效成分的提取分离，具有高选择性和良好的稳定性。

2.1.7用于有机酸类化合物的分离 朱秀芳等[19]采用氢化阿魏酸作为假模板分子，以4-乙烯基吡啶作为功能单体，在乙腈中对印迹聚合物进行制备，该聚合物对阿魏酸的识别能力良好。采用平衡吸附表征了聚合物对阿魏酸的吸附特性及分子识别性能，并采用紫外光谱滴定法和Scachard结合模型，研究了聚合物的印迹机理和识别机理。结果显示，该聚合物对阿魏酸的识别能力高于氢化阿魏酸，在体积分数为50%的乙腈水溶液中仍能有效识别阿魏酸。将该聚合物应用于从川芎水提液中分离阿魏酸，分离结果良好，表明该聚合物有望成为直接从药材中分离得到阿魏酸的提取材料。

2.1.8用于其他类化合物的分离 Faizal C K M等[20]通过相转换法制备维生素E印迹聚合物膜，实验选用的功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是丙烯腈，结果表明，与非印迹膜相比，单位质量的膜对维生素E的吸附量是它的10倍。Yin X Y等[21]采用穿心莲内酯作为模板分子制备分子印迹聚合物，作为柱填料应用于固相萃取，与碳十八、三氧化二铝和空白聚合物相比，该聚合物对目标分子的吸附效果具有明显的优越性。向海艳等[22]利用该成分作为模板分子，对白藜芦醇具有特异选择性的MIP进行合成。将静态平衡结合法和Scatchard分析法用于吸附性能评价的分析，结果显示，该印迹聚合物中形成2种不同的结合位点，能对白藜芦醇产生良好的吸附性能与选择性。在虎杖药材的提取分离中，采用白藜芦醇MIP并结合固相萃取技术，可以将大量白藜芦醇和少量与其结构相似的化合物白藜芦醇苷分离，这表明分子印迹分离法可应用于中药有效成分的分离纯化中。

2.2在分离得到多个结构类似物中的应用 在治疗某些疾病方面，可以充分运用中药复方多种药效成分的综合药理作用来达到治愈疾病的目的。近年来，药学科研工作者提出复方药物有效成分组学的概念，是指传统复方药物发挥疗效的全部活性成分总和。利用分子印迹技术的特异性分子识别特性，可以将其作为选择性分离材料，用于对药材中发挥特定药理作用的有效成分群进行提取分离。通过分析研究提取分离的化合物，可以为阐明中药复方的药效物质基础提供参考[23]。

朱秀芳等[24]利用橙皮苷为模板分子，结合MIT法，制备分子印迹聚合物，探讨该聚合物的吸附选择性能。结果显示，该聚合物能对橙皮苷及与其相似的黄酮苷类成分柚皮苷产生选择性吸附作用。López Mdel M等[25]将槲皮素作为模板分子，功能单体采用4-乙烯基吡啶合成分子印迹聚合物，结果显示这种聚合物能够很好地识别黄酮类成分槲皮素及黄烷类成分儿茶素，但不能识别α-生育酚这种结构差异较大的化合物。

2.3在中药有效成分测定中的应用 信建豪等[26]将盐酸小檗碱作为目标分子，以铁丝为磁芯，功能单体采用甲基丙烯酸，交联剂采用乙二醇二甲基丙烯酸酯，制备聚合成分子印迹搅拌棒。利用该搅拌棒对黄柏中的盐酸小檗碱进行提取分离，结合HPLC法测定，检出限为2.7 mg·L-1。

曾绍梅等[27]将樟柳碱作为模板分子，功能单体采用甲基丙烯酸，交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，致孔剂采用乙腈，利用沉淀聚合法，合成了对4种托烷类生物碱(樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品)具有类特异性识别能力的聚合物。以该分子印迹聚合物为固相萃取柱填料，采用分子印迹固相萃取-高效液相色谱法，富集并分离了藏药马尿泡中的4种托烷类生物碱成分。该方法检出限为0.26～0.39 μg·mL-1，可去除样品中的杂质干扰，提高马尿泡果实中4种托烷类生物碱的萃取效率。

2.4在手性物质拆分中的应用 手性药物在中药化学成分中常见，其对映异构体的药理作用和毒性反应往往差异巨大。Dong X等[28]在测定麻黄药材中的(-)-麻黄碱时，将(-)-麻黄碱作为模板分子，合成(-)-麻黄碱分子印迹聚合物，结果显示制备的聚合物能对(-)-麻黄碱产生很好的识别和亲和作用。

Ou J J等[29]在利用HPLC法对延胡索中的D-四氢巴马丁和L-四氢巴马丁手性对映体进行分离的过程中，首先采用原位MIT，以L-四氢巴马丁作为模板分子，合成印迹聚合物整体柱，结果显示，模板分子的识别性能非常好，之后反复摸索色谱条件，使得2种对映体达到满意的分离度。

2.5在中成药中非法添加化学药物检测中的应用 黄红萍等[30]建立了以分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定喘息灵中盐酸克仑特罗含量的方法。样品用乙醇超声提取，滤液蒸干，用体积分数为1%的盐酸溶解，加到处理过的盐酸克仑特罗分子印迹固相萃取小柱上，体积分数为25%的乙腈水溶液淋洗，甲醇-乙酸(9∶1)洗脱，洗脱液蒸干，用体积分数为1%的盐酸定容。以0.05 mmol·L-1磷酸二氢钠-甲醇(60∶40)为流动相。盐酸克仑特罗线性范围为0.4～40.0 μg·mL-1，分离效果良好。

2.6在活性成分筛选中的应用 中药中的化学成分十分复杂，在确定活性成分之后，可将其作为模板分子合成MIP，与模板分子构型相似的空穴和对应的作用位点就会留在MIPs上，产生特异的吸附性能，与模板分子结构类似的成分也会留在MIPs中。

中药藏锦鸡儿的乙酸乙酯提取物具有抑制表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的药理作用，槲皮素是一种天然的抗EGFR抑制剂。Zhu L L等[31]采用槲皮素MIPs，分离藏锦鸡儿乙酸乙酯提取物中的化学成分。结果显示，洗脱液的抗EGFR活性最强，其次是乙酸乙酯提取物，而淋洗液的活性最弱。这表明在洗脱液中，与槲皮素结构相近的化合物被选择性吸附于固相萃取柱上，结合高分辨质谱对其进行结构鉴定，确定为白皮杉醇和紫铆查耳酮。活性测试结果表明2种成分均有抑制EGFR的药理作用，相比于槲皮素，两者具有更低的IC50值。将(E)-白皮杉醇确定为模板分子，合成MIP，对紫铆查耳酮和槲皮素也具备特异的识别性能(这2种化合物均具有抗EGFR酪氨酸酶活性)。RD3-4078是一种丙肝病毒NS3蛋白酶抑制剂，将其作为模板分子制备MIPs，结合柱色谱技术，从选择性吸附于柱子上的叶下珠(Phyllanthusurinaria)粗提物中分离得到5个化合物，活性测试结果显示均对丙肝病毒NS3蛋白酶有抑制作用[32]。

3 结语

目前分子印迹技术已成功应用于中药研究的部分领域。在中药有效成分的分离纯化、获得多个结构类似物、中药有效成分的测定、手性物质拆分、中成药中非法添加化学药物的检测和活性成分筛选等方面均有应用。

MIP可进行中药活性成分的筛选研究。该技术尚存在一些需要进一步深入探索的问题，如分子印迹和识别过程的机制以及定量描述，在功能单体和交联剂的选择方面以及水相MIP等方面存在一定的局限性。对于小分子化合物，分子印迹聚合物的制备和识别相对容易，聚合物的制备方法较为复杂，且不易识别目标物质。对于新型材料的基础研究较多，但很少运用于实际研究中。印迹聚合物有制备简便、能重复应用等优点，且有机溶剂、酸、碱、热等因素不会对其分子识别能力产生影响，在中药研究领域的应用前景十分广阔。