尿路微生物与泌尿系统肿瘤相关性的研究进展

丁 煜,王 宁,王 晨,段黄琪,沈海波,齐 隽

(上海交通大学医学院附属新华医院泌尿外科,上海 200092)

我们体内的微生物通常被称为“被遗忘的机关”,拥有超过我们自己的基因组100多倍的元基因组,并对人体健康起到重要作用。认识到微生物在人类健康中的重要性,美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)启动了人类微生物组织计划(human microbiome project,HMP)。HMP研究已经清楚表明,各解剖部位的微生物群体与多种多样的人类健康和疾病状态相关。然而,最初的HMP研究中没有纳入人类尿路,与其他人类黏膜表面细菌物种的多样性相反,尿路通常被认为是“无菌”的,这可能是由于常规尿液细菌培养技术局限所致。随着下一代测序技术的应用,最近的研究表明,泌尿道存在独特的尿液微生物群,对泌尿系统疾病的发生发展起关键作用[1]。在这篇综述中,我们讨论了尿路细菌微生物可能导致癌变的作用,同时通过相关基础临床研究回顾尿液微生物与泌尿系统肿瘤相互作用的研究进展,特别专注于微生物与宿主相互作用的效应机制和治疗前景。

1 16S rRNA基因测序及尿液微生物

微生物由细菌、古细菌、病毒和真菌组成,主要发现于胃肠道,也存在于皮肤,上呼吸道和泌尿生殖道等。然而曾经被认为是无菌的其他组织,如脑,乳腺,胎盘和尿道,也具有独特的细菌群落[2-5]。传统上,尿细菌培养用于分离和鉴定参与泌尿道感染发展的病原体,例如需氧、快速生长的细菌微生物,如大肠杆菌和粪肠球菌[6]。相反,慢生长的、厌氧的或在合成培养基上不易生长的微生物,如棒状杆菌、乳杆菌和解脲支原体很少从尿道中分离,因为常规培养技术不是为了支持这些微生物属的生长而设计的。然而,使用先进的检测技术之后,这些细菌微生物在多个研究中已被确定为尿微生物群的成员[7-9]。

16S rRNA基因序列由于其关键细胞作用的结果,是高度保守的。然而在基因内,一些延伸可以演化,成为可以测量进化距离的超可变区域,从而有了系统进化相关性。16S rRNA基因的所有九个已知的高变区(V1～V9)含有足够的多态性,因此对一个V区进行测序通常足以实现准确的分型分类[10]。16S rRNA基因测序的一个限制是它不能区分活细菌和死细菌或细菌DNA片段。HILT等[11]通过扩大培养条件超越常规使用细菌分离尿液的方法来解决这个问题。用这种培养方法,使用传统培养技术的65个样品中有80%的培养物(其中92%为培养阴性，即<103CFU/mL)生长细菌。这些发现与其高通量测序结果的比较表明,通过16S rRNA基因测序在尿微生物群中发现的大多数细菌确实存活。

超深度焦磷酸测序揭示了健康个体尿液中(相对)最丰富的细菌分类群：乳杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属、普罗前科菌属、加德纳菌属和链球菌属,健康的尿液微生物群的特征在于乳酸杆菌在女性和棒状杆菌在男性中的优势[9,12]。同时女性样本比男性更多样化,一项尿液调查数据(用作膀胱微生物的代表)显示,相比于男性的样品(1至8属),来自女性(6至36属)的样品中存在更多的非均质的细菌属混合物[13]。虽然中期尿液分析证实了核心微生物细菌的存在,但核心细菌数量,以及其他细菌的占有率,在不同年龄组中都是多变的,这一观察结果在泌尿道中比在肠道微生物中更显着。例如,Jonquetella属、微单胞菌属、紫单胞菌科Proteiniphilum属和Saccharofermentans属主要存在于70岁以上的老年人[13]。

2 尿路微生物与前列腺癌

前列腺癌(prostatecancer,PCa),是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,是全世界范围内的一个重要的公共问题。相关数据表明,2010年以来,前列腺癌成为美国男性发病率第一的肿瘤,死亡率仅次于肺癌,2017年美国估计有161 360例新病例[14]。中国前列腺癌的发病率虽低于西方国家,但近年来其发病率和死亡率均上升明显,已经成为严重影响我国男性生命健康的肿瘤之一,估计前列腺癌的终生风险为16%[15],饮食、生活方式和遗传因素都是既定的风险因素。

2.1 前列腺癌相关的微生物组改变

2.1.1尿液微生物组 尿路微生物组的发现对于前列腺病理生理学具有重要意义,因为它们在解剖学上接近。在一项13个前列腺癌患者与21个前列腺增生患者的尿液、前列腺液检查(examination of prostatic secretion,EPS)、精液中微生物细菌的对照研究中表明,与BPH组相比,前列腺癌组尿液中的拟杆菌纲,α变形菌纲,厚壁菌门细菌,毛螺旋菌科,丙酸杆菌亚目Propionicimonas,鞘脂单胞菌属和苍白杆菌属的数量显着增加,并且优杆菌属和红螺菌科Defluviicoccus的数量减少。同时前列腺癌组中大肠埃希菌的数量在尿液中显着降低,在EPS和精液中增加；肠球菌在精液中数量显着增加,而尿液和EPS几乎没有变化[16]。在这些菌群中,α变形菌纲的增加可能与前列腺癌患者中所见的前列腺的感染和炎症有关；厚壁菌门细菌参与能量再吸收和肥胖[17]；Propionicimonas属于丙酸杆菌亚目,它是前列腺炎患者EPS中主要的厌氧菌；苍白杆菌属是一种机会性病原体,其数量越多代表患者的免疫功能障碍越严重。另一项包括66名前列腺癌患者和63名活检良性的患者尿液分析研究发现了一组聚集的细菌物种,它们比群集外的细菌更多比例的存在于癌症样本中,该簇包含物种链球菌属Anginosus,消化链球菌科Anaerococcuslactolyticus和Anaerococcusobesiensis,放线棒菌属Schaalii,放线菌科Varibaculumcambriense以及丙酸杆菌科Propionimicrobiumlymphophilum。几乎所有这些物种都被认为是泌尿生殖系统感染的致病因素,包括前列腺炎,细菌性阴道炎和尿路感染[18]。

2.1.2胃肠微生物组 以往研究非常多的胃肠微生物也可能通过代谢影响从而在前列腺癌发生发展中发挥潜在作用。一项前瞻性病例对照试点研究比较了8名良性前列腺疾病患者与12名局限性前列腺癌患者的粪便,结果显示在PCa病例中观察到较高的相对丰度的芽孢杆菌,在良性对照中观察到梭菌科Faecalibacteriumprausnitzii和优杆菌属Eubacteriumrectale具有较高的相对丰度。在遗传、酶和途径丰度方面,组间也观察到显着差异[19]。F.prausnitzii和E.rectale都是丁酸盐的生产者,丁酸盐抗肿瘤发生特性的研究已经通过诱导细胞凋亡和抑制增殖,以及体外模型中增加的细胞分化来证明其效果。相应地,体内研究已经证明丁酸盐能通过降低纤溶酶原活性水平以及促使血管内皮生长因子表达减少来发挥其抗肿瘤作用[20-21]。

2.1.3前列腺组织中微生物组 在组织中主要由痤疮丙酸杆菌组成的丙酸杆菌属也因其促炎症性、与PCa密切的相关性而成为近期热点。一项在16例根治性前列腺切除术标本上评估肿瘤、癌旁组织和非肿瘤组织的微生物组学特征的研究显示在肿瘤/肿瘤周围和非肿瘤前列腺标本中特定微生物群体存在显著差异：乳杆菌目、链球菌科、链球菌属在非肿瘤组织上表现更多而葡萄球菌科、葡萄球菌属在肿瘤/肿瘤周围组织中表现更多；最重要的是同时在3种组织的所有属中,丙酸菌属都是最丰富的[22]。在另1项100例前列腺癌患者及50例前列腺活检良性的患者对比研究中发现,痤疮丙酸杆菌在男性前列腺癌中较之对照组更常见。在多变量分析中,调整年龄、手术日历年和吸烟状况后,痤疮丙酸杆菌数量多的男性患前列腺癌的几率增加4倍。研究人员已经从前列腺组织标本中培养出与人类皮肤痤疮丙酸杆菌相关的促炎微生物,并且已经显示其在人类和动物模型中与前列腺炎有关。基于细胞的实验里,痤疮丙酸杆菌分离株与前列腺细胞系PNT1A共培养,观察到感染细胞中细胞增殖和细胞因子/趋化因子分泌增加[23]。最近,KASIMATIS等[24]报道,与寻常痤疮相关的痤疮丙酸杆菌菌株含有质粒,而质粒含有几个毒力相关基因。这些研究都进一步支持痤疮丙酸杆菌感染作为前列腺癌发展的促成因素的生物合理性。

2.2 促炎症微生物及微生物菌群失调的促前列腺癌作用SIMONS等[25]模仿典型的人类前列腺感染,逆行尿道滴注一种从患有慢性前列腺炎的患者的前列腺液中分离的B1克隆组大肠杆菌菌株(anE.colistrain of the B1 clonal group isolated from the expressed prostatic secretion of a patient with chronic prostatitis,CP1),在前列腺癌Hi-Myc小鼠模型中的CP1感染加剧了侵袭性前列腺腺癌的发展,其中70%以上的小鼠在4.5个月龄时患有癌症,此项研究证明了前列腺炎症能促进前列腺癌进展。抗生素的使用也会改变人体内的微生物细菌微环境,从而影响肿瘤的发生发展,一项研究表明对于尿路肿瘤,使用青霉素、喹诺酮类、磺胺类药物和四环素类药物对前列腺癌的风险略有增加,对于>5个疗程的青霉素,OR为1.2(95%CI为1.1～1.3)[26]。此外,研究人员已经证明胃肠道微生物群的生态失调会增加前列腺癌的风险[27]。同时一项美国东南部的研究中40名前列腺癌患者被随机分配,并予以不同饮食,其结果表明不同的摄入食物与不同肠道微生物菌群正相关,并且在基线时,变形菌门(中位数0.06,四分距范围0.01～0.16)丰富,其中四目与Gleason评分(Gleason score,GS)总和正相关。GS总和与梭菌属(r=0.579;P=0.005)以及Blautia(r=0.425,P=0.049)有关[28]。

2.3 免疫学上的冷肿瘤及微生物在前列腺癌免疫治疗中的作用迄今为止,尽管在其他实体瘤(如黑色素瘤)中取得了有希望的进展,但免疫疗法在前列腺癌患者中显示出很小的治疗益处。在前列腺癌中,基于免疫接种和基于免疫检查点阻断的免疫治疗策略都观察到有限的治疗效果[29-31]。对前列腺癌免疫治疗缺乏临床反应的最主要原因可能是低突变负荷和/或低肿瘤新抗原负荷导致前列腺癌的低免疫原性以及存在替代检查点或免疫逃逸途径。前列腺癌的治疗如去势、盆腔放疗等可能改变肠道微生物菌群[32]从而影响免疫治疗。目前来说,与免疫学上的“热”癌症如黑素瘤和膀胱癌相比,前列腺癌中由于抗肿瘤浸润免疫细胞的缺乏(可能由于低突变负担)被认为是“冷”癌症。另外在病理上由于前列腺癌倾向于在良性腺体之间渗透,因此定义前列腺癌中的肿瘤边缘或肿瘤周围区域通常是困难的[33]。

近年来的一些研究已经证明肠道微生物群对于诸如环磷酰胺、奥沙利铂化疗以及CTLA4阻断和抗PDL1免疫疗法的治疗功效是必不可少的。通过抗生素治疗或衍生无特定病原体和/或无菌动物根除共生肠道菌群消除了这些药物的治疗功效[34-36]。因此人为地改变肠道微生物群能提升一些抗肿瘤免疫治疗的疗效,例如在小鼠黑色素瘤模型中抗PDL1免疫治疗的效果可以通过在开始治疗前给动物喂养双歧杆菌特定菌株得到加强[37]；另一项研究中,将富集拟杆菌属微生物细菌的小鼠粪便移植到无菌小鼠中,与对照组相比,其粪便中脆弱拟杆菌的粪便丰度更多并在CTLA4阻断后减小了肿瘤大小[34]。虽然目前在前列腺癌中还没有关于胃肠道微生物群与免疫疗法反应之间相互作用的数据,但是随着未来的研究的深入,胃肠道微生物对前列腺癌的免疫治疗的影响及机制肯定能被挖掘发现。

3 尿路微生物与膀胱癌

膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤,在我国近年来膀胱癌的发病率和病死率逐渐上升,且中国男性膀胱癌死亡率(3.89/105)是女性(1.34/105)的2.9倍[38]。其中尿路上皮癌(urothelial bladder cancer,UBC)是最多见的病理类型,其已知的最重要的危险因素是吸烟和各种职业暴露,血吸虫感染与慢性炎症与膀胱鳞状细胞癌的发生有关。根据肿瘤的分期标准,可把膀胱癌分为肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)和非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC),初诊患者中约70%为NMIBC,约30%为MIBC。男性的膀胱癌发病率是女性的2～5倍,其差异长期以来被解释是男性吸烟率更高,但是相较于肺癌,女性吸烟的增加并没有导致膀胱癌的显着增加。随着近年来对微生物与癌变机制的不断深入认识、发现尿微生物群的存在,以及男性和女性尿微生物群之间存在显着差异使我们重新考虑膀胱癌的预防和危险因素。

3.1 膀胱癌相关的微生物改变细菌微生物能够与许多环境毒素相互作用,如重金属、多环芳烃、农药、赭曲霉毒素、塑料单体和有机化合物。在通过肾脏过滤从血液中除去某些毒素之后,它们在膀胱内的储存提供了足够的时间使尿微生物群与这些化合物相互作用和改变,这种“代谢”可以增加或减少可能由这些毒素引起的疾病的风险,包括认知功能障碍,肾脏病理甚至是尿路系统癌症[39]。一项研究使用454测序技术对来自健康个体(n=6)和尿路上皮癌患者(n=8)的尿标本进行了微生物研究,大多数正常样本中链球菌丰度接近零(0～0.017),但在8个癌症样本中的5个(0.12～0.31)显着升高。在链球菌丰度低的2个癌症样品中(2/3)假单胞菌属或嗜球菌属是最丰富的属[40]。2017年POPOVIC等[41]对比了12名膀胱癌男性患者与11名健康男性的尿液微生物分析,在膀胱癌组中鉴定了一种显著丰富的属于梭杆菌属的操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),而韦荣氏菌属,链球菌属和棒状杆菌属的3种OTU在健康的尿液中更丰富。2017年的另一项抗生素使用对癌症形成风险的研究表明,在没有膀胱过度感染的患者中,当青霉素和磺胺类药物的处方数分别达到1.3(95%CI:1.1～1.5)和2.0(95%CI:1.1～3.4)时,癌症风险增加。在曾接受过膀胱感染的患者中,接触>5个疗程的青霉素和大环内酯类患者的风险仍然较高,其中校正比值比(adjusted odds ratio,AOR)分别为1.4(95%CI:0.7～2.6)和2.1(95%CI:0.5～8.1)[26]。这些结果表明尿路上皮癌可能与尿路改变的微生物群有关。

3.2 血吸虫相关膀胱癌血吸虫病属于由血吸虫属寄生虫引起的被忽视的热带病,在贫困地区普遍存在,且针对血吸虫病的治疗选择仅限于吡喹酮。在血吸虫中,比起曼氏血吸虫和日本血吸虫,埃及血吸虫更容易引起膀胱病理改变[42-43]。泌尿生殖系统血吸虫感染有助于膀胱癌的发生,但其具体机制还未完全清楚,通常我们认为血吸虫感染导致卵子在膀胱壁中沉积从而引起的损伤以及尿路上皮慢性炎症对膀胱癌的发生发展有很大影响[44-45],血吸虫感染相关的微生物组生态失调近年来也被认为是一个可能的危险因素。JENKINS等[46]发现与未感染的小鼠相比,曼氏血吸虫感染的小鼠肠道微生物群中疣微菌(Verrucomicrobia)门中的Akkermansiamuciniphila和乳酸杆菌明显增加。最近的一项对泌尿生殖系血吸虫病患者尿液微生物组的研究则表明,埃及血吸虫感染组和未感染组之间的微生物群落存在差异[47]。未来还需要更多的数据及样本来确定血吸虫感染相关的微生物变化与膀胱癌发生之间的详细关联。

3.3 卡介苗在膀胱癌治疗中的应用卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)是正式的一种预防结核病的疫苗,在膀胱中它是一种分枝杆菌,也可以看做是一种放线菌。虽然BCG灌注仍然被认为是膀胱肿瘤经尿道切除术后最有效的无创治疗方法,但相当一部分患者确实出现复发,因此许多工作集中在改善BCG治疗尿路上皮癌疗效的策略上。一些研究者单独使用免疫刺激/细胞因子(CpG寡脱氧核苷酸、BAMLET、IFNa2b等)或与BCG共同施用,来比较二者治疗效果差别,但是其结果不一[48-50],之后转基因及重组BCG作为替代方法被广泛开发[51-52]。2016年的一项研究则从免疫记忆的角度发现,动物试验中在开始原位肿瘤攻击之前用BCG进行疫苗接种改善了膀胱内BCG治疗的反应；更重要的是,对临床资料的分析显示预先存在BCG免疫的患者在BCG免疫治疗后具有更大的获得无复发存活的可能性[53]。有趣的是,STEDMAN等[54]最新的研究发现欧洲獾粪便中分离的12个乳酸菌对BCG具有显着的抑制活性,并在人巨噬细胞分析中影响BCG介导的免疫激活,由此我们可以假设,BCG灌注的疗效也可能与肠道以及尿路菌群有紧密的关联,而这也有待进一步的研究来证明。

3.4 微生物组织可能在预防复发性浅层膀胱癌中发挥作用虽然罕见,BCG治疗还是会有危及生命的不良反应,例如,0.4%的患者发展为BCG脓毒症,因此研究成为替代方案治疗是有必要的[55]。在其他暴露的黏膜部位,例如肠道或口腔活动中,共生细菌在维持宿主体内平衡方面是必不可少的,有趣的是在2013年,一个研究小组表明乳酸杆菌L.iners比来自阴道样品或益生菌的其他乳杆菌拥有对纤连蛋白更强的亲和力[56],并且在小鼠中干酪乳杆菌减少了可移植膀胱肿瘤和肺转移的生长[57]。在体内研究中一项138例原发性膀胱肿瘤患者的多中心、双盲、安慰剂对照、随机试验报道,每日口服给予冷冻干燥的干酪乳杆菌Shirota1年可以有效降低膀胱癌在经尿道电切除肿瘤后复发[58]。另外一项多中心,前瞻性,随机对照试验纳入207例患者,表明患者口服1年干酪乳杆菌联合经尿道表柔比星灌注(3个月)治疗和仅仅表柔比星灌注组相比,3年时的膀胱癌复发率显着降低,尽管组间总生存率没有差异[59]。除了降低膀胱癌复发的几率,一项180例患者和445例基于健康人群对照组的病例对照研究显示,常规(每周1～2次)益生菌摄入降低了健康人群的UBC风险[60]。不仅是干酪乳杆菌对膀胱癌有疗效,我们还知道共生细菌可以很容易地结合几种被认为与膀胱癌有关的化合物,如镉,其他重金属和杀虫剂[61]。合理有选择性地使用益生菌、促进或消耗本地膀胱微生物组合的策略在未来可能会用于改善UBC治疗的疗效。

3.5 微生物组作为膀胱癌生物标志物及靶向治疗选择微生物除了与膀胱癌的发生发展有密切关联,特定的微生物组还能作为诊断和预后的生物标志物。在最近的一项31名膀胱癌男性患者与18名健康男性的尿液对比研究中,复发和进展风险高的患者的微生物群组成与复发和进展风险低的患者有显着差异,且复发风险高以及进展风险高组别中各有6个特异性属[62]。同时微生物组在调节对癌症治疗的反应中起着至关重要的作用,包括免疫疗法[63]。ZITVOGEL等[64]报道微生物组可能影响PD-L1阻断的治疗效果,因此特定的微生物组还具备着免疫药剂靶向治疗的潜在选择。

4 其他泌尿系统肿瘤

目前尿路微生物与其他泌尿系统肿瘤例如肾癌、肾盂癌、输尿管癌、阴茎癌等的相关性研究还没有开展很多,还有待更多的基础及临床研究来确定其关联性是否如前列腺癌及膀胱癌一样密切。

5 总结与展望

即使在一度被认为是无菌的泌尿系统,细菌微生物也无处不在。大量研究已经证实了泌尿系统肿瘤,特别是前列腺癌及膀胱癌,与尿路细菌微生物之间存在关联。然而,就目前而言,泌尿系统肿瘤及尿路细菌微生物之间的具体相关性机制尚未完全清楚,我们仍需要进一步的基础和临床研究来确定这些特定细菌微生物的作用及其作为新生物标志物开发的潜力,为泌尿系统肿瘤的预防及治疗提供新的方向及手段。