PI3Kp110β抑制剂对人舌鳞状细胞癌CAL27细胞增殖与凋亡的影响

陈福海，郑安元，温思露，李芬，陶泽璋

舌鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of tongue，TSCC)是口腔内常见的恶性肿瘤，约占口腔癌的30%[1-2]，也是最常见的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)之一[3]。据统计，我国每年新增口腔癌病例4.81万[4]，严重威胁着我国人民的身体健康。传统的舌鳞状细胞癌治疗方法一般包括手术切除以及配合术后放疗和化疗等，但近30年来舌鳞状细胞癌患者的总体生存率并没有得到显著提高，其5年生存率仍低于60%[5-7]。临床研究表明，患者死亡的原因主要在于舌鳞状细胞癌的局部复发和远处转移[8]，因此寻找其机制及关键靶点有助于对患者进行及时的早期治疗，对改善患者预后具有非常重要的临床意义。PI3K是PI3K/Akt/mTOR信号通路的关键节点及上游分子[9-10]，并且有研究表明，在一系列因素的作用下，PI3K的异常激活可以引起其下游分子的激活[11]，从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡以及上皮间质转化(EMT)和血管生成等效应[12-13]。因此抑制PI3K的活性可有效缓解上述效应，有利于肿瘤的治疗[14-16]。KIN-193是PI3Kp110β亚型的选择性抑制剂，并且已有研究表明其细胞毒性较低，安全性较好[17]。因此，本实验观察了人舌鳞状细胞癌CAL27细胞在不同浓度KIN-193作用下的细胞增殖能力、凋亡程度以及形态学变化，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞与试剂：人舌鳞状细胞癌CAL27(中国科学院上海细胞资源中心)；澳洲Gibco胎牛血清(美国Invitrogen公司)；高糖DMEM、PBS、DMSO及0.25 %胰酶Trypsin(杭州吉诺生物公司)；细胞增殖和毒性检测试剂盒CCK-8 (日本同仁化学研究所)；蛋白提取试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物公司)；Cell-LightTMEdU Apollo®567 In Vitro Imaging Kit(广州锐博生物公司)；KIN-193(美国MCE，MedChemExpress公司)；目的蛋白抗体(美国Cell signaling tech公司)。(2)仪器设备：二氧化碳培养箱(美国Thermo Scientific公司)；倒置显微镜(德国徕卡仪器有限公司)；全自动显微镜(日本奥林巴斯公司)；全自动酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)。

1.2 实验方法 2018年1—7月于武汉大学人民医院中心实验室进行实验。人舌鳞状细胞癌CAL27的培养及药物浓度： CAL27细胞用含10%胎牛血清 (FBS) 及青霉素+链霉素溶液的高糖DMEM培养基20 μg/ml于37 ℃ 5 %CO2培养箱中常规培养，取对数生长期细胞，用胰酶消化，分组培养。用DMSO溶解KIN-193配置10 mmol/L的母液，取适量KIN-193母液用完全培养基稀释为终浓度为0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、30 μmol/L的KIN-193溶液加入到对应分组细胞中进行培养。

1.2.1 细胞形态学观察： 人舌鳞状细胞癌CAL27培养及KIN-193溶液共同培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞形态学并摄片记录。

1.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡： 将处于对数生长期的CAL27细胞用胰酶消化后，取适量加入含有细胞爬片的24空板内。第2天细胞贴壁后，加入不同浓度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃ 于5 %CO2培养箱中常规培养48 h，然后应用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，在全自动显微镜下观察细胞凋亡并拍照记录。

1.2.3 细胞存活能力检测： 将CAL-27细胞悬液浓度调至2×107个/L，每孔加入100 μl到96空板内，在37 ℃的 5 %CO2培养箱中常规培养。第2天细胞贴壁后，加入不同浓度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，每组设置3个复孔，分24、48、72 h 3个时间段进行培养，在对应时间取CCK-8 10 μl加入到每孔中，并在37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光光度值，计算相应药物浓度细胞存活率。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力： 将CAL-27细胞悬液浓度调至1×107个/L，然后每孔加入250个细胞到6空板内。第2天细胞贴壁后，加入不同浓度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃ 于5 %CO2培养箱中常规培养12 d，然后PBS洗一遍六孔板，再用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，克隆形成实验检测计数细胞，计算克隆形成率(克隆形成率=细胞克隆形成数/原始种入孔内细胞数)。

1.2.5 细胞增殖能力： 将处于对数生长期的CAL27细胞用胰酶消化后，将适量的CAL27细胞加入含有细胞爬片的24空板内。第2天细胞贴壁后，加入不同浓度的KIN-193(0、10、20、30 μmol/L)，在37 ℃于 5 %CO2培养箱中常规培养48 h，然后应用Cell-LightTMEdU Apollo®567 In Vitro Imaging Kit，在全自动显微镜下观察细胞增殖能力并拍照记录。

1.2.6 细胞蛋白浓度： 将处于对数生长期的CAL27细胞用胰酶消化后传代，将传代好的细胞分成4组，第2天细胞贴壁后，分别加入终浓度为0 μmol/L(对照组)、10、20、30 μmol/L 的KIN-193溶液共同培养72 h。收集CAL27细胞，用裂解液裂解收集细胞，离心后取上清，BCA 法测定蛋白浓度，调平蛋白浓度，加1/4总体积的4×LDS和1/10总体积的DTT，水浴变性蛋白，10 %凝胶电泳，转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃下孵育过夜，然后孵育二抗。采用Western-Bloting经Odyssey双色红外激光成像系统扫描，并分析处理显影蛋白条带。

2 结 果

2.1 CAL27细胞形态学改变 随着KIN-193浓度的增加，在倒置显微镜下观察到CAL27细胞的贴壁数量依次减少，而漂浮死亡的细胞增多，细胞体积变小，细胞由长条形变成圆形，且在细胞周围出现许多突起，细胞边界模糊不清，见图1A(插页Ⅰ)。

2.2 CAL27细胞凋亡的影响 在0、10、20、30 μmol/L的KIN-193干预CAL27细胞48 h后，与对照组相比，加药组绿色荧光更强，并且CAL27细胞的凋亡呈浓度依赖性增高 (F=7.428，P=0.000)，见图1B(插页Ⅰ)。

2.3 CAL27细胞存活能力 CCK-8实验结果表明，随着KIN-193作用浓度和时间的增加，CAL-27细胞的活力明显被抑制 (24 h、48 h、72 h 的F值与P值分别为：F=6.682，P=0.001；F=14.428，P=0.000；F=38.549，P=0.000)，见图2。

2.4 CAL-27细胞的克隆形成能力 实验结果表明，KIN-193能够明显抑制CAL-27细胞的克隆形成能力，并且随着药物浓度增加而克隆形成数量减少(F=75.141，P=0.000)，见图3(插页Ⅰ)。

2.5 CAL27细胞增殖作用 EdU实验结果表明，随着KIN-193作用的浓度增加，CAL-27细胞的增殖明显被抑制，在KIN-193为30 μmol/L 时，对CAL27细胞的增殖抑制最强(F=6.885，P=0.000)，见图4(插页Ⅰ、Ⅱ)。

图2 不同浓度KIN-193对CAL27细胞存活率的影响

2.6 CAL27细胞蛋白表达 KIN-193干预CAL27细胞48 h后，随着KIN-193药物浓度的增加，CAL27细胞的 PI3Kp110β蛋白表达量明显下降，且药物作用的浓度越高，蛋白表达量下降的程度越大(F=4.312，P=0.04)，见图5。

图5 不同浓度KIN-193干预CAL27细胞72 h后 Western blotting的结果

3 讨 论

目前恶性肿瘤成为一种常见疾病，舌鳞状细胞癌作为常见的恶性头颈部肿瘤之一，时刻危害着人类的健康。舌鳞状细胞癌恶性程度较高，因其具有丰富的血液及淋巴循环，所以其通常在术后还会有较高的复发率并且容易出现转移[18]。舌鳞状细胞癌较难早期诊断，一般发现时已是晚期，极大地危害着患者的生命。通常治疗采取手术及术后放化疗，但临床上化疗药物不良反应较大，并且因舌鳞状细胞癌容易对化疗药物产生耐药，一般患者预后极差。

PI3K/Akt/mTOR已被证明在肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成中发挥着关键作用[19-20]，抑制PI3K的活性可有效缓解上述效应，有利于肿瘤的治疗[21-23]。但目前大多PI3K抑制剂因抑制PI3Kp110亚基中的全部亚型(包括p110α、p110β、p110γ、p110δ)而使得其肝肾细胞毒性较大[24-26]，另外不可口服以及性质不稳定也使得其未能进行更深入的研究，限制了它们在临床上的使用。PI3K分子一般分为3型，其中I型PI3K研究最多，且与肿瘤的关系最为密切[27]。I型PI3K由调节性亚基p85及催化亚基p110组成，当p85与p110结合减弱甚至分离时，PI3K中的p110亚基被激活发挥其生物学活性。因此，针对p110亚基的靶向治疗有望成为将来新的治疗靶点。目前在头颈部肿瘤p110亚基的抑制剂中，p110α和p110δ抑制剂研究最多，而关于p110β及p110γ的抑制剂在头颈部肿瘤中的研究目前尚未有报道。而KIN-193属于PI3Kp110β的选择性抑制剂，可有效抑制PI3Kp110β[28]，通过文献检索，目前KIN-193尚未在肿瘤中进行大规模研究。因此，本文研究具有较强的创新性。另外有研究表明，PI3K信号通路不仅与其他肿瘤的发生发展相关，而且在舌癌的增殖迁移等过程中也发挥着重要作用[29-30]。因此，本研究观察了人舌鳞状细胞癌CAL27细胞在不同浓度的PI3Kp110β亚基抑制剂KIN-193作用下的细胞增殖能力、凋亡程度以及形态学方面的变化。

肿瘤的引发不仅是细胞异常增殖分化的结果，同时也是细胞凋亡调控障碍的结果，当细胞的凋亡受到抑制，且不能恢复，就会导致机体细胞数量的增加，而引发肿瘤[31-34]。凋亡的调控是细胞生理死亡和肿瘤发生的重要机制，对于各种刺激诱导下细胞凋亡机制的分析有助于深入了解肿瘤细胞的生物学及发现新的治疗对策。CCK-8实验及克隆形成实验结果都表明随着KIN-193浓度的增加，CAL-27细胞存活率及增殖能力逐渐降低，这表明KIN-193可有效地抑制CAL-27细胞的增殖。进一步的TUNEL染色实验及细胞形态学变化结果也表明KIN-193可促进口腔肿瘤CAL-27细胞的凋亡。此外，本结果表明，KIN-193对PI3Kp110β的抑制作用随着KIN-193浓度的增强而增强，且与不同浓度的KIN-193抑制CAL27细胞的增殖和促进其凋亡的趋势一致，这也提示着在人舌鳞状细胞癌CAL27细胞的促增殖、抗凋亡的肿瘤特性在一定程度上与PI3K分子的p110β亚型的激活相关。但KIN-193具体是通过何种细胞凋亡途径促进细胞凋亡的，其机制有待进一步研究。此外，本研究仅停留在细胞水平，后续还需进行KIN-193在体内的效应研究。总而言之，KIN-193能够有效地抑制口腔癌CAL27细胞的增殖，促进其凋亡。

利益冲突：无

作者贡献声明

陈福海：提出研究思路、设计研究方案、实施研究过程、分析试验数据、论文撰写和论文修改；郑安元、李芬、温思露：处理数据、论文修改；陶泽璋：课题设计、论文修改和论文审核