微小RNA-320在食管癌组织中的表达及其临床意义

张晓安 兰碧洋 罗 强

(广西壮族自治区民族医院/广西医科大学附属民族医院胸心外科，南宁市 530001，电子邮箱：753972@qq.com)

食管癌是临床较为常见的恶性肿瘤，占食管肿瘤的90%以上[1]。食管癌起病隐匿，多数患者就诊时已处于中晚期，而目前临床对晚期食管癌的治疗尚缺乏有效手段[2]。手术结合放化疗可大大提高早期食管癌患者的治愈率，但对于晚期食管癌患者，其术后5年生存率仅为20%左右[3]。因此，寻找食管癌的早期诊断标记物对食管癌的临床诊疗具有重要意义。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类长度为18～24 bp的内源性小RNA，其在多种组织中均有表达。微小RNA-320属于肿瘤抑制miRNA，可通过抑制肿瘤细胞的增殖、肿瘤组织血管形成从而抑制肿瘤的发生与发展[4]。文献报道，微小RNA-320在结直肠癌[5]、宫颈癌[6]等肿瘤组织中表达异常，但关于微小RNA-320在食管癌组织中的表达及其临床意义的研究较少。因此，本研究检测并对比食管癌患者癌组织及癌旁正常组织中微小RNA-320的表达水平，探讨微小RNA-320表达水平与食管癌患者病理特征的相关性，并分析微小RNA-320与食管癌患者预后的关系，以期为食管癌的临床诊疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 组织样本 收集2012年6月至2014年6月间我院收治的100例食管癌患者的食管癌组织和对应癌旁正常组织(距癌组织边缘≥1 cm)样本。所有患者的临床病理资料均完整；食管癌组织均经病理检查证实为原发性食管癌，癌旁组织样本均经病理证实为正常食管组织；患者手术前均未接受放疗或化疗。所有样本均通过手术获取，经生理盐水清洗后液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存待检。100例食管癌患者中，男性53例，女性47例；年龄28～74(53.64±2.95)岁；胸上段食管癌19例，胸中段食管癌53例，胸下段食管癌28例；低分化21例，中分化32例，高分化47例；原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期：Ⅰ期24例、Ⅱ期38例、Ⅲ期27例、Ⅳ期11例；合并淋巴结转移37例。

1.2 主要试剂与仪器 逆转录试剂盒(批号：1321067)、实时定量PCR试剂盒(批号：4427368)、7500型实时定量PCR仪均购自美国ABI公司；TRIzol试剂(批号：15596026)购自美国Invitrogen公司；SmartSpec Plus分光光度计购自Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计：采用Primer premier 6.0软件设计引物，并委托上海生工生物工程有限公司进行合成。微小RNA-320上游引物序列为5′-CACATCACGCTGAAAGGGCAGTGGGATTGA-3′，下游引物序列为5′-CACATAGCCCTCGCTGGGACTC-3′；内参U6上游引物序列为5′-CCTGCGGCTTCGACACA-3′，下游引物序列为5′-ACAGCTTCGCTTTAAACGGT-3′；微小RNA-320逆转录引物序列为5′-ATACCCTGGTCGTGTGGTAGCAACGGTTCTTAGGAGTCCGCCCT-3′；内参U6逆转录引物序列为5′-ACGTTCAAACGTTTGTGCCATGT-3′。

1.3.2 样本总RNA提取：取5 g样本组织超声匀浆，按TRIzol试剂盒说明书提取组织中总RNA，采用分光光度计检测RNA纯度及浓度；取1μL RNA行1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，将电泳条带清晰者用于实时定量PCR检测。

1.3.3 逆转录反应：按照逆转录试剂盒操作说明书进行逆转录反应，反应体系为20 μL。于0.1 mL EP管中分别加入10×RT buffer 1.5 μL、1 μmol/L逆转录特异性引物3 μL、100 mmol/L dNTPs 0.15 μL、20 U/μL RNA酶抑制剂0.19 μL、50 U/μL MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL、RNA样品 1 μL，然后加焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水补至20 μL。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 s；反应后产物置于-20℃保存。

1.3.4 实时定量PCR反应：按照PCR试剂盒操作说明书进行操作，反应体系为20 μL，包括逆转录产物cDNA 1 μL、TaqMan GEx Master Mix 10 μL、引物1 μL、DEPC水8 μL。反应条件：95℃ 10 min；92℃ 15 s，60℃ 1 min；40个循环。采用相对表达量法计算微小RNA-320表达水平，以2-△Ct表示癌组织及癌旁组织中微小RNA-320的相对表达量，△Ct=CtmiR-320-CtU6。

1.4 随访 随访根据国际抗癌联盟推荐指南，于食管癌患者手术当月开始，术后第1年每3个月随访1次，术后第2年及第3年每半年随访1次，随访期限为36个月，随访截止时间为2017年6月。随访期内以患者死亡为随访终止事件，患者术后出现复发和(或)转移判定为病情恶化。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料采用M(P25，P75)表示，组间比较秩和检验。采用Kaplan-Meier生存曲线、log-rank检验和Cox回归模型分析微小RNA-320表达水平与患者预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 微小RNA-320的表达水平与临床病理特征的关系 食管癌组织中微小RNA-320的相对表达量为0.57(0.41,0.68)，低于癌旁正常组织的1.19(0.83，1.37)(z=9.394，P<0.001)。食管癌组织中微小RNA-320的表达水平与患者的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及浸润程度有关(均P<0.05)。见表1。

2.2 食管癌组织中微小RNA-320的表达水平与患者预后的关系 所有研究对象均获随访，中位随访时间为19个月，随访期内有74例患者出现病情恶化，有9例患者死亡。参照文献[7]，以微小RNA-320中位相对表达水平0.4为截断值区分表达高低(≥0.40为高表达，<0.40为低表达)。微小RNA-320高表达者中位生存时间为23个月(95%CI：19.2～25.3)，微小RNA-320低表达者中位生存时间为11个月(95%CI：9.5～13.7)；经log-rank法检验，微小RNA-320高表达者中位生存时间高于低表达者(χ2=3.194，P=0.027)，见图1。以食管癌患者的年龄、性别、临床病理特征为自变量，生存状态和生存时间为因变量，纳入Cox回归多因素模型分析；结果显示，微小RNA-320表达水平是食管癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

图1 不同微小RNA-320表达水平患者的Kaplan-Meier生存曲线图

3 讨 论

miRNA广泛存在于真核生物中，且存在形式多样，目前已在动植物及病毒中发现28645个miRNA 分子，其主要以基因簇、单拷贝或多拷贝等形式存在[8-9]。正常生理状态下，机体内miRNA表达遵守严格的组织、时序特异性；但在肿瘤环境下，往往出现miRNA的异常表达[10]。既往研究表明，miRNA不仅对分子靶信使RNAs(messenger RNAs,mRNAs)的转录及翻译有抑制作用，还可促进mRNAs降解，从而调控细胞的代谢、增殖、分化及凋亡等，尤其在肿瘤的发生及发展过程中起到关键作用[11]。研究证实，食管癌中存在多种miRNA的异常表达，提示miRNA参与食管癌的发生与发展[12]。因此，深入研究miRNA与食管癌之间的关系对其临床诊疗具有重要作用。微小RNA-320是新发现的miRNA，定位于人类第8号染色体。研究发现，微小RNA-320在多种恶性肿瘤组织中表达异常，其失衡表达可促进恶性肿瘤的发生与发展，发挥着类似于抑癌基因的作用[13-15]，但关于微小RNA-320在食管癌组织中的表达研究报道较少。

本研究通过检测食管癌组织和对应癌旁正常组织中微小RNA-320的表达水平，发现微小RNA-320在食管癌组织中的表达低于癌旁正常组织(P<0.05)，该结果与其他肿瘤中微小RNA-320的表达情况相似[16-17]，这说明微小RNA-320的低表达可能在某种程度上促进食管癌的发生。本研究结果显示，不同分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况及浸润程度的食管癌患者中微小RNA-320的表达水平不同(均P<0.05)，即微小RNA-320表达越低，肿瘤分化程度越低，TNM分期越高，浸润程度越深，也越容易发生淋巴结转移，提示微小RNA-320作为抑癌基因可能参与食管癌的发生、发展、侵袭及迁移等过程。此外，生存分析结果显示，微小RNA-320低表达者中位生存时间短于微小RNA-320高表达者，提示微小RNA-320低表达与食管癌患者预后不良有关，上调微小RNA-320的表达水平可能有助于改善食管癌患者的预后，延长患者的生存时间。本研究中微小RNA-320表达水平与食管癌患者年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤直径等临床病理特征无明显关系，这说明微小RNA-320的表达不易受个体因素或其他因素影响，结合生存分析结果，我们认为其可能是食管癌早期诊断及疗效判定的潜在生物学标记物。因此，重视食管癌组织中微小RNA-320的检测，有助于判断食管癌及其组织学进展，可为临床治疗方式的选择提供参考。

综上所述，微小RNA-320在食管癌组织中呈低表达，且与食管癌分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况、浸润程度及患者预后有关，提示微小RNA-320或许可作为食管癌临床治疗的新靶点及预后评价的一个指标。今后应增加样本量，对微小RNA-320与食管癌的发生发展进行深入研究，以期为临床诊治及预后评估提供更有意义的参考依据。