甜高粱茎秆持汁性研究进展

冷传远 郝怀庆 景海春

（1. 中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室，北京 100093；2. 中国科学院大学，北京 100049）

高粱（Sorghum bicolor）是世界第五大禾谷类作物，是干旱及半干旱地区的主要粮食作物（http：//www.fao.org）。高粱为C4植物，光合效率高，生物产量大。此外，高粱具有较强的抗逆性和适应性，被称为“沙漠中的骆驼”。高粱品种BTx623于2009年完成全基因组测序，其基因组约为730 Mb，是玉米全基因组的1/3。因其基因组较小，重复序列少的特点，使其成为研究甘蔗亚族和其他C4作物功能基因组学的一个较好的模式作物［1］。甜高粱是普通高粱的变种，属于禾本科（Gramineae），高粱族（Andropogoneae）高粱属（Sorghum）甜高粱种［Sorghum bicolor（L.）Moench］栽培甜高粱亚种［Sorghum bicolor（L.）Moench subsp.bicolor］。甜高粱用途广泛，可用于生产粮食、糖浆、酒精及青贮饲料等，被公认为是重要的基于糖、淀粉发酵生产乙醇的第一代能源植物和基于纤维素发酵生产乙醇的第二代能源植物［2-6］。

1 高粱茎秆持汁性的意义

甜高粱作为上述这些产业的重要原料，是因为其茎秆富含水分和糖分。茎秆占甜高粱生物学产量的70%，是甜高粱重要的能量储存器官［7］，含有蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖。它们是生产乙醇、提高青贮饲料品质的主要原料［8-9］。

高粱茎秆中的水分是糖分等光合产物的主要载体，茎秆出汁量对甜高粱的产糖量非常重要。黎大爵和廖馥荪用出汁量和汁液锤度（Brix）（锤度表示汁液中可溶性糖的含量）估算茎秆用于发酵的可溶性糖的产量，即茎秆中可发酵糖分产量=出汁量×锤度［10］。Sankarapandian等［11］的研究表明在乙醇生产过程中茎秆出汁量的贡献率高达122.6%。陈连江等［12］得出甜高粱茎秆出汁量与生物产量、汁液锤度、糖分含量等品质性状间相关性均达到显著或极显著水平。赵香娜等［13］认为出汁量与锤度呈极显著正相关；锤度与单株茎秆鲜重呈极显著正相关。Guan等［14］也认为茎秆中糖产量受株高、茎和叶鲜重、茎秆中汁液的锤度及重量的影响。Sanjana Reddy等［15］的研究表明提高茎秆出汁量能显著提高茎秆糖产量。

此外，甜高粱有很大一部分被用作青贮饲料的制作。青贮饲料是将含有一定水分的新鲜青绿植物材料经切碎后放在密闭容器内，通过微生物（乳酸菌）厌氧发酵，达到保存、保鲜目的而制成的饲料［16］。适宜的水分含量对于青贮饲料的品质有重要影响。一般青贮原料水分含量要求为65%-75%，水分含量较低或者较高都会对青贮饲料的品质产生不利影响［16-18］。水分含量较低，会导致原料在青贮时不易被压实，窖内残留空气，使原料发霉变质；同时含水量降低还会使原料在青贮过程中产热过多，使pH值升高乙酸含量增加，乳酸菌及其他一些发酵产物含量降低。青贮原料的含水量过高，首先是渗液问题，不仅会丧失大量养分，对环境造成不利影响，同时高水分易引起梭菌生长，降低发酵品质。

鉴于甜高粱茎秆中水分的重要作用，克隆与鉴定调控高粱茎秆水分的基因，揭示其遗传规律和分子机理具有重要的理论价值和应用价值。中国高粱种质资源丰富，栽培历史悠久，所以多年来关于中国高粱的起源和进化问题一直为国内外学者所关注，而从目前所掌握的资料来看，都认为甜高粱是从非洲传入中国的［19］。通过挖掘与重要性状相关的功能基因，通过群体选择分析探究各亚群的多态性和分化程度，进而探讨群体的遗传结构、基因交流、物种形成机制及群体进化动态问题是当前的研究热点［20-23］。茎秆持汁性作为甜高粱的重要特征，对其进行深入研究不仅有助于了解控制茎秆持汁性的关键基因及具体生物学功能，还有助于了解甜高粱的起源和驯化过程。

2 高粱茎秆持汁性的研究历程

2.1 Dry/D基因的定位与克隆

人们克隆与鉴定调控高粱茎秆水分的基因主要围绕叶脉颜色、持汁性、含水量和汁液产量进行。Benson和SubbaRao［24］于1906年首次发现当高粱茎秆无汁时，叶片中脉呈白色；当有汁时，叶片中脉的颜色为绿色。通过构建遗传群体，研究发现茎秆持汁性受单基因控制，茎秆有汁为隐性，基因型为d，茎秆无汁为显性，基因型为D［25-27］。后续的实验发现控制茎秆水分的D基因与控制高粱幼苗出土时茎尖颜色的Rs基因和控制叶鞘紫色的P基因存在连锁，Rangaswami等［27］研究表明在高粱中控制叶鞘紫色的P基因与控制茎秆含汁性的D基因的重组率为30%。D的精细定位最初是通过叶脉的颜色来进行的。通过将叶脉分为白脉和绿脉，Xu等［28］将D基因定位到SBI-06上两个RFLP标记（umc34和txs1030）之间，Hart等［29］认为D基因与SSR标记txp97连锁。2010年，Mace等［30］通过“projection strategy”的方法将D基因定位到SBI06上84.2-93.2 cM之间，与SSR标记txp145紧密连锁。2014年Zhai等［31］对两套独立的F2群体观察分析，将D基因锁定在6号染色体上只包含6个候选基因的区间范围内。

以高粱茎秆的出汁量或者含水量作为指标，研究认为高粱茎秆水分含量是数量性状，受到多个QTL位点控制。通过测量不同节间的含水量，Han等［32］定位到一个控制高粱茎秆含水量的显著位点，位于6号染色体上Ch6-2和gpsb069之间，其对各个节间含水量变异的解释率为34.7%-56.9%，进一步通过BSA测序的方法，将这一区间缩小到339 kb，包含38个候选基因。这一位点与之前报道的控制叶脉颜色的位点相同。此外，也发现了其他的一些QTL位点。Felderhoff等［33］分别以出汁量和含水量为指标，发现在1号、3号、4号和7号染色体上存在显著的QTL位点。Guan等［14］以出汁量为指标，将控制茎秆出汁量的位点定位到了染色体SBI-01的 Xcup25- SEST249、Xtxp329-Xtxp088和 Xtxp284-Xtxp061区间，染色体SBI-04的Sb1_10-SbAGG02区间，染色体SBI-07的SbAGF06-Xcup19区间和染色体SBI-09的Sb5_206-SbAGE03区间，其中位于染色体SBI-07和SBI-09的区间在两种自然环境下均能检测到。然而，由于作图亲本的选择和自然环境的影响，在这些研究中并没有发现D位点与茎秆中的水分相关。2015年，Burks等［34］通过全基因组关联分析的方法将控制叶脉颜色的位点、出汁量的位点和含水量的位点同时定位到6号染色体——51.8 Mb的区域。这些研究说明含水量是受多基因控制的数量性状，而最初定义的控制汁液有无的单基因D是控制含水量、出汁量的主效基因。对D基因研究的突破性工作出现在2018年。Zhang等［35］将高粱的茎秆分为“pithy”和“juicy”两类，通过全基因组关联分析和图位克隆的方法，最终克隆到了控制高粱茎秆持汁性的D基因，并将其命名为Dry，并且进一步通过转基因的手段验证了Dry基因的功能。该基因编码植物特有的NAC转录因子，其功能缺失是甜高粱茎秆富含汁液的重要原因。同年，Fujimoto［36］、Xia［37］和 Casto［38］也分别通过图位克隆的方式鉴定到D基因，并且Fujimoto［36］通过异源表达的方式在拟南芥中验证了D基因的功能，而Xia等和Casto等并没有对D基因的功能进行验证。

2.2 Dry基因的作用机制

通过细胞学及生理生化实验，Zhang等［35］发现Dry基因参与次生细胞壁的合成，Dry功能缺失会影响甜高粱茎秆髓部维管束和薄壁细胞的形态、细胞壁厚度及细胞壁组分。进化树分析表明Dry与控制次生细胞壁合成的VND、NST和SMB基因家族亲缘关系较近［35］。同时也发现，在Dry基因功能丧失的材料中与纤维素、半纤维素合成相关的MYB转录因子和功能基因的表达也发生变化，因此Dry是一类新的控制次生细胞壁合成相关的基因［35］。推断当Dry基因功能丧失以后，不利于水分在高粱茎秆内的运输，因此甜高粱茎秆内积累了大量的水分。

在Fujimoto等［36］的研究中，他们发现Dry基因与程序化细胞死亡有关。Dry基因在拟南芥中的同源基因是ANAC074，将Dry基因在ANAC074的突变体中异源表达，取拟南芥的花序轴，用伊文思蓝进行染色，发现花序轴被染成蓝色。利用雌激素诱导系统，发现当添加雌激素后，表达LexA∷D和LexA∷ANAC074的拟南芥细胞的细胞核和质体发生丢失。同时表达LexA∷D和LexA∷ANAC074的拟南芥细胞以及D/d的高粱近等基因系材料中，检测到与程序化细胞死亡相关基因，如CEP1和XCP1家族的肽酶相关基因，编码type-II metacaspases的基因，PASPA3、SCPL48、BFN1和RNS3的表达发生变化。在Casto等［38］的试验中，他们也发现程序化细胞死亡的标志基因SbXCP1在SbNAC_D的近等基因系中的表达量显著高于在SbNAC_d1的近等基因系中的表达量，并且在高粱品种R07020中，SbXCP1的表达量与通气组织的形成相关。

2.3 Dry基因在高粱的起源驯化过程中受到选择

Zhang等［35］通过PCA分析发现，野生高粱、籽实高粱和甜高粱能非常明显的区分开。此外，全基因组水平的LD分析发现三者的衰减速度为野生高粱＞籽实高粱＞甜高粱。这说明甜高粱可能经历了比籽实高粱更强的选择驯化过程。野生高粱和籽实高粱茎秆中的水分含量很低，而甜高粱的茎秆中含有大量水分，因此推测Dry基因可能在高粱的起源和驯化中起重要作用。进一步通过XP-CLR证实了在甜高粱Dry处存在明显的正选择信号，并且Dry的核酸多态性低于野生高粱和籽实高粱［35］。对Dry基因的单倍型进行分析，发现在野生种中存在23种单倍型，在籽实高粱中仅存在2种单倍型（Pithy_SUD和Pithy_CHN），在甜高粱中存在4种单倍型（Juicy_IND、Juicy_RSA、Juicy_ZIM 和 Juicy_USA），并且籽实高粱的2种单倍型与野生高粱的353_type和394_type是相同的。进化树分析发现甜高粱Juicy_IND是由籽实高粱Pithy_CHN产生的［35］。因此Dry在甜高粱的起源与驯化过程中受到选择，Dry基因从野生高粱驯化为栽培无汁高粱受到瓶颈效应，导致遗传多态性降低；筛选Dry突变体是选育有汁甜高粱的关键一步。

3 展望

3.1 高粱茎秆持汁性与叶脉颜色之间的关系

通过农杆菌介导的方法将Dry基因导入甜高粱品种Keller，尽管Keller茎秆的持汁性发生变化，但是叶脉的颜色并没有从绿色变为白色。因此我们认为Dry并不是控制叶脉颜色的主要基因，而是与之紧密连锁。控制叶脉颜色的基因与Dry紧密连锁在一起，可能是由于叶脉的颜色易于观察，因此在育种过程中人们有意识的选择造成的。Xia等［37］通过GWAS和图位克隆的方法将控制叶脉颜色的基因定位到了6号染色体上——36 kb的区间。在该区间包含除Dry基因以外的3个基因。明确其中哪一个基因决定了叶脉颜色还需要进一步研究。

3.2 茎秆持汁性与茎秆含水量之间的关系

Burks 等［34］利用GWAS的方法将控制水分含量和出汁量的基因定位到了Dry基因所在的位置，此外在1号染色体和5号染色体上也存在与含水量相关的显著位点。Guan等［14］以出汁量为指标，将控制茎秆出汁量的位点定位到了染色体SBI-01的 Xcup25- SEST249、Xtxp329-Xtxp088和 Xtxp284-Xtxp061区间，染色体SBI-04的Sb1_10-SbAGG02区间，染色体SBI-07的SbAGF06-Xcup19区间和染色体SBI-09的Sb5_206-SbAGE03区间。因此，在Dry基因控制茎秆持汁性的基础上，还需要对调控茎秆水分含量相关的其他微效基因进一步挖掘，以便为深入了解茎秆水分含量的精细调控机理奠定理论基础。

3.3 茎秆持汁性与茎秆含糖量之间的关系

由叶片光合作用生成的光合产物，主要以蔗糖的形式运输到各个库器官，而茎秆中的水分是糖分等光合产物的主要载体。在甜高粱茎秆中，光合产物主要以可溶性糖的形式储存于茎髓部薄壁细胞中，可溶性糖的积累会引起渗透压的提高，这是否会影响水分的吸收，或者水分含量是否会影响可溶性糖的积累都是需要进一步明确的问题。在前人的研究中也发现了同时控制水分量和Brix的QTL位点。但是植物如何调节其自身的水分含量和糖含量使其达到平衡目前尚未可知。此外，目前对于高粱茎秆中糖含量的测定主要是通过测定Brix进行的，然而Brix的测定较为粗糙，受环境和发育时期的影响较大。同时高粱中的糖分除了蔗糖之外，还包含葡萄糖、果糖和淀粉等。因此精准定量高粱茎秆中的各种糖分含量、水分含量与糖分含量之间的关系也是今后的研究重点。

3.4 茎秆持汁性与籽实大小之间的关系

在甜高粱中，茎秆和籽实都是储能器官。研究发现茎秆和籽实之间存在能量竞争关系，然而目前对这方面研究的并不深入。这方面的研究可以帮助诠释作物/植物茎秆储水在水分与养分转运、“源-库”信号交换方面的作用。另外，甜高粱各品种间籽实的大小也存在差异，因此对甜高粱籽实差异的研究有可能找到甜高粱特异的调控籽实大小的途径。

3.5 茎秆持汁性与持绿间的关系

Dry基因在拟南芥中的同源基因是At4g28530。研究发现在叶片衰老过程中At4g28530的表达量升高［39］。Dry基因在水稻中的同源基因是Os4g43560。研究发现在适度干旱的条件下，Os4g43560在耐旱材料的幼穗中表达量升高，而在不耐旱的材料中表达量未发生变化［40］。在高粱中我们也发现籽实高粱的衰老普遍早于甜高粱，因此Dry基因在衰老中的作用也是今后的一个重要研究方向。

综上所述，甜高粱茎秆水分含量是由多基因控制的，目前只克隆到一个主效基因Dry，但是对于其作用机理和调控网络并不十分清楚，仍需进一步深入研究。同时，克隆其他控制基因对精细调控茎秆水分含量，明确茎秆持汁性对茎秆物质积累和同化产物竞争有无作用具有重要理论价值和应用价值。