巴戟天多糖的理化性质及其对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响

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(1.海南省农业科学院农产品加工设计研究所,海南海口 571100; 2.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉 430070; 3.江西生物科技职业学院,江西南昌 330200)

巴戟天(MorindaofficinalisHow)亦称鸡肠风、鸡腿藤,属于茜草科(Rubiaceae)巴戟天属植物[1],是我国“四大南药”之一,主要分布在广东、广西、海南、福建等地。巴戟天中含有多糖、有机酸、环稀醚萜苷类、挥发油等多种营养成分,具有抗抑郁[2-3]、降血糖[4]、补肾阳[5]、缓解骨质疏松[6-7]以及增强免疫力[8]等多种生物活性。多糖是巴戟天的主要活性成分之一,含量高达13.45%～24.37%[9]。

目前,国内对巴戟天抗骨质疏松活性方面进行了一些研究,如朱孟勇等[10]研究表明巴戟天多糖能够提高切除卵巢后骨质疏松大鼠骨密度;姜克明[11]研究表明巴戟天糖聚物能促进成骨细胞增殖。这些研究主要说明,巴戟天多糖具有预防骨质疏松作用。目前,未对其促进成骨细胞MC3T3-E1增殖的具体指标进行全面评价,未测定其理化性质,这不利于巴戟天多糖的深入研究与应用。因此,本试验以海南产巴戟天为原料,在纤维素酶辅助提取巴戟天多糖的基础上,通过化学和仪器分析法研究巴戟天多糖的pH、相对黏度、溶解性、光谱特征、空间构像等理化性质;采用噻唑蓝法和酶联免疫法,研究其对MC3T3-E1细胞增殖率、Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COLⅠ)和骨钙素(osteocalcin,OCN)分泌量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响,以期为巴戟天应用于预防治疗骨质疏松方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巴戟天 产自海南省五指山市;小鼠成骨细胞株MC3T3-E1 美国菌种保藏中心;纤维素酶(400 U/mg) Sigma公司;胎牛血清、α-MEM培养基 Gibco公司;碱性磷酸酶检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;噻唑蓝(MTT) 阿拉丁试剂有限公司;乙醇、氯仿、正丁醇、硫酸、苯酚等 广州化学试剂厂。

680型酶标仪 美国Bio-Rad公司;TU-1810分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;CO2培养箱 日本Sanyo公司;TH2-C-1摇床 太仓市实验设备厂;FLBP-1000A型粉碎机 上海菲力博食品机械有限公司;雷磁PHSJ-4F型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;CPA225D电子天平 德国Sartorius公司;NDJ-5S旋转黏度计 上海越屏科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 巴戟天多糖提取 在前期研究的基础上,提取巴戟天多糖。将巴戟天洗净,置于50 ℃下烘36 h,粉碎,过40目筛,经乙醚脱脂后,进行多糖提取纤维素酶用量1500 U/g、温度50 ℃、pH5.0、底物质量浓度50 g/L,时间1.5 h,浸提,抽滤,旋转蒸发浓缩,95%乙醇沉至终浓度70%,活性炭脱色2次,Sevage试剂(正丁醇∶氯仿=4∶1)脱蛋白4次,旋转蒸发浓缩,真空冷冻干燥,得到巴戟天多糖提取物。

1.2.2 巴戟天多糖提取物的理化性质测定

1.2.2.1 pH和相对黏度测定 配制2 mg/mL多糖水溶液(25 ℃),pH计测定5 min内的稳定数值,即为巴戟天多糖的pH[12]。配制10 mg/mL巴戟天多糖水溶液,测定黏度(25 ℃),同时测定去离子水黏度,计算相对黏度(μr),μr=巴戟天多糖水溶液黏度(μ)/去离子水黏度(μs)[13]。

1.2.2.2 化学成分分析 依次采用硫酸-苯酚法[14]、碘-碘化钾反应、斐林试剂反应、茚三酮反应测定巴戟天多糖提取物[15],判断其是否含有多糖、淀粉、还原糖、氨基酸或蛋白质。

1.2.2.3 多糖溶解性测定 将巴戟天多糖提取物配成2 mg/mL溶液,分别置于(20、40、60、80、100 ℃)下水浴溶解,磁力搅拌(150 r/min),测定巴戟天多糖的完全溶解时间[16]。

1.2.2.4 紫外光谱特征测定 配制0.5 mg/mL巴戟天多糖溶液,以蒸馏水为空白,利用紫外分光光度计在波长200～400 nm范围内测定吸光值,绘制巴戟天多糖紫外光谱特征曲线[17]。

1.2.2.5 空间构象分析 采用刚果红实验[18]分析多糖样品空间构象。称取多糖样品5～10 mg,加蒸馏水2 mL、80 μmol/L刚果红试剂2 mL。加入1 mol/L的NaOH溶液,至溶液NaOH终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L,于200～800 nm光谱扫描,测量不同NaOH浓度下溶液最大吸收波长。以蒸馏水作为空白对照,比较反应体系的最大吸收波长变化情况。

1.2.3 巴戟天多糖对MC3T3-E1细胞增殖的影响

1.2.3.1 MC3T3-E1细胞增殖活性测定 参考夏光华等[19]方法,用α-MEM培养基将对数期MC3T3-E1细胞浓度调整为1.5×104个/mL,每孔100 μL接种至96孔板中,培养24 h后更换培养基,加入巴戟天多糖提取物,浓度为(0、6.25、12.5、25、50 μg/mL),每孔加入200 μL,培养72 h后。在测定前4 h加入MTT溶液(终浓度0.5 mg/mL),培养4 h后吸弃培养液,加入200 μL酸化异丙醇,充分吹打,使蓝色结晶完全溶解,570 nm测定处吸光值。MC3T3-E1细胞增殖率按照下列公式计算:

细胞增殖活性(%)=(样品吸光值/空白吸光值)×100

1.2.3.2 MC3T3-E1细胞COL Ⅰ和OCN含量测定 取密度为2×104个/mL的MC3T3-E1细胞接种于24孔板,每孔1 mL,24 h后,换浓度为(0、6.25、12.5、25、50 μg/mL)巴戟天多糖提取液,培养7 d后,收集培养液,按照酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒方法检测COLⅠ和OCN含量。

1.2.3.3 MC3T3-E1细胞ALP活力测定 参考陈宏杰等[20]方法,取细胞浓度为9×104个/mL的MC3T3-E1细胞接种于12 孔板中,每孔接种1 mL,待48 h后,分别用质量浓度为(0、6.25、12.5、25、50 μg/mL)的巴戟天多糖提取物干预,培养诱导分化5 d,去除培养液,用含质量分数1% TritonX-100的细胞裂解液裂解细胞,取上清液,根据碱性磷酸酶检测试剂盒的说明操作测定该上清液的ALP活力。

1.3 数据处理

测定所得数据均重复三次,结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件、Excel 2007进行数据统计分析,Origin 8.5软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 巴戟天多糖的理化性质

2.1.1 pH和相对黏度 巴戟天多糖提取物pH为6.15±0.13,呈弱酸性,可能是巴戟天多糖含有呋喃环结构[15]、糖醛酸、硫酸根等基团[21],使溶液呈弱酸性。巴戟天多糖提取物相对黏度1.26±0.12,与文献报道的多糖相对黏度相符,如与李然等[17]测定的白三叶多糖相对黏度(1.24±0.09)相似,其相对黏度的差异可能与巴戟天多糖化合物的大小、结构、所带净电荷有关。

2.1.2 化学成分分析 巴戟天多糖提取物中若含有淀粉、还原糖、蛋白质、氨基酸成分,会对其活性产生不利影响。通过化合物中官能团与某些试剂发生特征反应,产生不同颜色或沉淀来判断提取物中是否含有上述化合物。巴戟天多糖提取物与硫酸-苯酚反应呈红棕色,进一步验证其具有多糖的特性;与碘-碘化钾无蓝色现象,说明其未含有淀粉;与斐林试剂反应无砖红色沉淀生成,说明不含有还原糖;与茚三酮反应无显色反应,说明不含氨基酸或蛋白质。

2.1.3 溶解性 不同温度下测定巴戟天多糖提取物的溶解时间如图1所示。从图1可知,随着温度升高,巴戟天多糖的溶解时间逐渐减少,100 ℃时,巴戟天多糖的溶解时间仅为(3.55±0.25) min,溶解效率最高,这可能是因为温度升高,分子运动加剧,利于多糖溶解。这与李然等[17]测定的白三叶多糖溶解性变化趋势相似,但溶解时间随温度的变化有一定差别,这可能与原料自身性质有关。

图1 巴戟天多糖溶解性Fig.1 Solubility of polysaccharides from Morinda officinalis How

2.1.4 巴戟天多糖紫外光谱图 巴戟天多糖提取物的紫外光谱图如图2所示。从图2可知,巴戟天多糖提取物在260、280 nm处均无吸收峰,说明不含核酸、蛋白质,该结果与2.1.2茚三酮反应结果一致。

图2 巴戟天多糖紫外光谱图Fig.2 UV spectrum of polysaccharide from Morinda officinalis How

2.1.5 空间构象 多糖的活性与多糖分子一级、空间结构有关,三股螺旋结构是多糖分子中最具活性的空间构象[22]。在低浓度NaOH溶液下,刚果红可与具有三股螺旋结构的多糖形成络合物,溶液最大吸收波长增加;较高NaOH溶液下,三股螺旋结构解开,不能形成络合物,溶液最大吸收波长下降[23],因此,可通过刚果红试验,推测多糖是否具有三股螺旋结构。由图3可知,当NaOH浓度为0～0.3 mol/L,巴戟天多糖样品最大吸收波长向长波方向移动;当NaOH浓度大于0.3 mol/L,最大吸收波长下降,说明巴戟天多糖在较低碱浓度条件下,以有序的三股螺旋结构存在;碱浓度较高时,分子间氢键破坏,多糖三股螺旋结构解体,不能与刚果红形成络合物,由此推测巴戟天多糖提取物具有三股螺旋结构。

图3 不同NaOH浓度刚果红-巴戟天多糖络合物紫外光谱最大吸收波长Fig.3 UV spectrum maximum absorption wavelength of Congo red-polysaccharides from Morinda officinalisHow at various NaOH concentrations

2.2 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

2.2.1 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞增殖率的影响 成骨细胞在调控骨形成和骨吸收平衡中起着非常重要的作用。在骨形成过程中,成骨细胞要经历增殖、分化、矿化等阶段[24]。细胞增殖率是成骨细胞不同时期增殖的直观表现,增殖率越高,说明增殖活性越强,促进骨形成能力越强[19],具有潜在改善骨代谢或骨质疏松作用。由图4可知,巴戟天多糖提取物可以明显提高MC3T3-E1细胞增殖活性,呈明显量效依赖关系。当巴戟天多糖提取物浓度大于12.5 μg/mL时,MC3T3-E1细胞增殖率与对照组相比呈极显著增加(P<0.01),且在浓度为50 μg/mL时,MC3T3-E1细胞增殖率达到149.67%,明显优于夏光华等[19]纯化鲫鱼卵唾液酸糖蛋白(浓度400 μg/mL时,增殖率153.57%)和陈宏杰等[20]制备的鸡蛋黄蛋白质水解产物(浓度1 mg/mL时,增殖率129.87%),这可能是因为巴戟天多糖提取物能有效促进成骨细胞有丝分裂,抑制成骨细胞凋亡[25],且浓度越高,相对应的促进和抑制作用越强。

图4 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞增殖的影响Fig.4 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on proliferation of MC3T3-E1 cells 注:*表示与对照组相比,差异显著(P<0.05),**表示与对照组相比,差异极显著(P<0.01),图5～图7同。

2.2.2 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞分泌COLⅠ的影响 COLⅠ是骨组织形成的先决条件和成骨细胞早期分化标志[26]。如图5所示,巴戟天多糖提取物能够明显促进MC3T3-E1细胞分泌COL Ⅰ,呈量效依赖关系。当巴戟天提取物浓度为12.5 μg/mL时,COLⅠ分泌量与对照组相比呈显著增加(P<0.05);当浓度为25、50 μg/mL时,COLⅠ分泌量与对照组相比呈极显著增加(P<0.01),且在质量浓度为50 μg/mL时,COLⅠ分泌量较对照组提高44.98%,可能是巴戟天多糖提取物能有效促进骨基质胶原的合成[27],且浓度越高,促进作用越强。表明巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞分泌COLⅠ具有明显促进作用。

图5 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞分泌COLⅠ的影响Fig.5 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on COLⅠsecretion of MC3T3-E1 cells

2.2.3 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞OCN含量的影响 OCN是成骨细胞特异合成和分泌的一种非胶原蛋白,具有维持骨组织正常矿化作用,是成骨细胞成熟的标志物[28-29]。如图6所示,巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞分泌OCN具有显著促进作用,当质量浓度为6.25 μg/mL时,OCN分泌量与对照组相比呈显著增加(P<0.05);当质量浓度大于12.5 μg/mL时,OCN分泌量与对照组相比呈极显著增加(P<0.01),且当浓度为50 μg/mL时,OCN的分泌量较对照组增加85.01%,可能是巴戟天多糖提取物能有效促进成骨细胞核心结合因子表达,促进OCN分泌[30]。表明巴戟天多糖提取物能够显著促进MC3T3-E1细胞分泌OCN。

图6 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞分泌OCN的影响Fig.6 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on OCN secretion of MC3T3-E1 cells

2.2.4 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞中ALP活力的影响 ALP是成骨细胞分泌的同源二聚体糖蛋白,特异性高,是成骨细胞分化成熟的主要标志之一。ALP活性升高,表示成骨细胞活动增强[28,31]。由图7可知,随着巴戟天多糖质量浓度增加,ALP活力增加,二者呈量效依赖关系。当巴戟天多糖提取物浓度大于12.5 μg/mL时,ALP活力与对照组相比呈极显著提高(P<0.01),且当浓度为50 μg/mL时,ALP活力较对照组提高了258.95%,优于Ji等[32]提取的鸡蛋卵黄水溶性蛋白(142.4%±13.6%),可能是巴戟天多糖提取物能有效促进成骨细胞分化,提高ALP活力[25],且浓度越高,促进作用越强。表明巴戟天多糖提取物可以明显提高MC3T3-E1细胞ALP活力。

图7 巴戟天多糖提取物对MC3T3-E1细胞中ALP的影响Fig.7 Effects of polysaccharides extracted fromMorinda officinalis How on ALP activity of MC3T3-E1 cells

3 结论

巴戟天多糖属于酸性多糖,pH为6.15±0.13,相对黏度为1.26±0.12,具有糖的特性和三股螺旋结构,溶解性较好,不含蛋白质或多肽。与对照组相比,巴戟天多糖提取物浓度为50 μg/mL时,MC3T3-E1细胞增殖率极显著增加(P<0.01),为对照组的149.67%,COLⅠ分泌量、OCN的分泌量、ALP活性极显著提高(P<0.01),分别提高了44.98%、85.01%和258.95%,说明巴戟天多糖提取物能明显促进MC3T3-E1细胞增殖与分化,具有潜在改善骨代谢或骨质疏松作用,有望开发成预防骨质疏松产品。