白藜芦醇干预口腔炎性骨吸收作用及机理的实验研究进展

米 靖 仇丽鸿

口腔炎症性骨吸收疾病主要包括慢性根尖周炎、牙周炎等，其共同表现是长期存在的感染及病原刺激物导致组织慢性炎症反应，以至牙槽骨的吸收破坏，与细菌感染及炎症介质的产生和氧化应激等有关。近几年研究发现白藜芦醇具有治疗口腔炎症性骨吸收疾病的潜能。

一、白藜芦醇的理化性质

白藜芦醇（resveratrol，Res）又称芪三酚，是非黄酮类的多酚化合物，分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.25，性状为白色无味针状结晶，熔点在256～257℃，波长365nm 的紫外光照条件下可以产生荧光，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂而难溶于水，与碱性溶液如氨水等作用可显红色，与三氯化铁-铁氰化钾可发生显色反应，可以利用此性质鉴定白藜芦醇。天然的白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、松树等天然植物或果实中的植物抗毒素[1]。多项研究表明白藜芦醇具有很多药理作用，比如抗氧化、抗癌、抗炎、免疫调节和神经保护等作用，近年来深受生物医学界的重视。

二、白藜芦醇治疗口腔炎症性骨吸收疾病潜在机制

1.白藜芦醇的抗炎作用

慢性根尖周炎及慢性牙周炎病损组织中可以检测到高水平的炎症因子表达，包括白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[2]。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）及牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodontalis，P.e）脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是重要致病因子，Antonietta Rizzo[3]及Zhen[4]分别用P.g-LPS 刺激人牙周膜细胞和牙龈上皮细胞后发现细胞高水平表达IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎症因子，而经过白藜芦醇作用后上述炎症因子的表达下降；P.e-LPS诱导成骨细胞表达基质金属蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13），白藜芦醇可以抑制P.e-LPS 引起的成骨细胞MMP-13 表达和分泌[5]。LPS刺激小胶质细胞引起TNF-α 高表达，与不同浓度的白藜芦醇作用后细胞分泌TNF-α 的量明显减少并呈现出剂量依赖性[6]。Ma[7]等人发现白藜芦醇可以减轻LPS 诱导的鼠巨噬细胞炎症反应，降低IL-6的表达。除此之外，根尖周炎和牙周炎的发生发展还与IL-17 有着密切关系，Casati MZ 建立了小鼠牙周炎模型，模型组IL-17 表达量升高，白藜芦醇处理组IL-17水平则显著降低，但是两组IL-1β和IL-4的表达水平没有差异[8]。除上述炎症因子外，白藜芦醇还可以通过抑制Toll 样受体（toll like receptor，TLR）如TLR-4 来抑制炎症反应，Liu L 等用IL-1β刺激软骨细胞后，TLR-4 表达增高，白藜芦醇作用后与对照组相比TLR-4 表达降低，Capiralla 等用LPS 处理小胶质细胞后得出同样结论[9～11]。

2.白藜芦醇的抗氧化应激作用

氧化应激（oxidative stress，OS）是指在遭受各种有害刺激时，组织或细胞内自由基的产生与抗氧化防御系统之间存在着严重失衡，活性氧蓄积导致损伤的过程。生理状态下，机体组织内自由基的产生与清除保持动态平衡，当自由基过度产生或者抗氧化防御体系功能受损时，机体将处于氧化应激状态[12]。氧化应激状态可以使炎症因子如IL-8、TNF-α 等分泌增加，加速炎症发展并加重牙槽骨的破坏[13，14]。Gan[15]等人发现氧化应激可以显著降低成骨细胞活性，并呈现出时间依赖性，细胞的矿化能力也显著降低，证明氧化应激可以导致成骨细胞功能失调。

线粒体呼吸链是产生ROS 的一个重要途径，白藜芦醇可以通过调节该途径减少ROS 的生成[16]。线粒体呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ是细胞内ROS 的重要来源，白藜芦醇可以调节复合体Ⅰ，改变线粒体NAD+/NADH 比例[17]，还可以通过与辅酶Q 竞争降低复合体Ⅲ活性，不仅可以抑制ROS 的产生，也可以清除已经产生的ROS[18，19]。

Naofumi 的实验证明白藜芦醇可以通过Sirt1/AMPK 和Nrf2 抗氧化途径来减轻鼠牙周炎模型中的氧化应激程度，与牙周炎组相比，白藜芦醇处理组Nrf2、HO-1、NQO-1 的mRNA 表达量升高，iNOSmRNA 表达量降低，同时牙槽骨吸收程度与对照组相比明显缓解[20]。Rita 等人用双氧水刺激人牙龈成纤维细胞建立氧化应激模型，比较白藜芦醇、槲皮素、NAC 三种药物的抗氧化效果发现白藜芦醇与其他药物相比能增强细胞增殖，清除绝大部分ROS，刺激Ⅰ型胶原纤维形成，调节线粒体呼吸反应，可以作为治疗氧化应激失调的补充药物[21]。ROS可以诱导氧化/抗氧化系统失衡，引起小鼠骨丢失，口服白藜芦醇则预防了因氧化应激造成的骨丢失[22]。Hung 等[23]发现白藜芦醇可以清除体内自由基并抑制自由基的形成，减轻DNA 的损伤。综上所述，白藜芦醇可以通过抑制ROS 生成及清除已产生的ROS，并通过调节相关信号通路起到抗氧化的作用。

3.白藜芦醇调节骨代谢的作用

慢性根尖周炎及牙周炎的特征性表现为成骨细胞与破骨细胞调节的骨代谢平衡被打破导致的牙槽骨的破坏[24]。成骨细胞是形成骨的主要细胞，起源于多能骨髓基质的间质细胞，白藜芦醇可以促进骨髓基质细胞向成骨细胞的分化，并且可以提高碱性磷酸酶和脯氨酰羟化酶的活性，具有剂量依赖性[25]。Patrice[26]等人发现白藜芦醇可以促进人骨髓间充质干细胞表达成骨细胞标志物，如骨钙素（osteocalcin）和骨桥素（osteopontin），表明白藜芦醇具有促成骨作用。除此之外，白藜芦醇还可以通过雌激素受体（E2）激活ERK 通路，促进成骨细胞分化基因如RUNX2、OCN 的表达[27]。

除了促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化外，近年来有学者发现白藜芦醇可以诱导牙源性干细胞向成骨细胞分化。Zhang[28]发现白藜芦醇通过SIRT1 来促进人牙周膜干细胞及根尖牙乳头干细胞向成骨细胞分化，白藜芦醇处理干细胞后成骨分化的标志如ALP 活性、矿化能力、以及成骨相关基因（ALP、骨钙素、骨桥素）均有不同程度的提高。

核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）和骨保护素（osteoprotegerin，OPG）在破骨细胞形成过程中发挥着重要作用。Zhao[22]等在小鼠成骨细胞中加入金属离子，导致RANKL/OPG 比值升高，而白藜芦醇作用后与对照组相比OPG/RANKL 比值维持在正常水平，避免了金属离子诱导的破骨细胞形成。Mehdi[29]发现白藜芦醇对RANKL 产生抑制作用，并呈现出时间及浓度依赖性。值得注意的是白藜芦醇不是简单的促进或者抑制OPG 生成，而是维持其稳定水平。在OPG/RANKL 降低时促进OPG 生成，而在一些刺激因素如PGD2、PGE2 等作用在成骨细胞后引起OPG 上调时，起到降低OPG 的作用[30，31]。

综上，白藜芦醇不仅可以促进骨髓基质细胞及牙源性干细胞向成骨细胞分化，还能抑制破骨细胞的形成，发挥多种作用维持牙槽骨重建与吸收的平衡，起到保护牙槽骨的作用。

三、白藜芦醇调控疾病相关信号通路

目前已发现多条信号通路参与了白藜芦醇调控口腔炎症性骨吸收疾病的发展，其中NF-κB、SIRT1、p38MAPK 等信号通路的作用最关键。这些信号通路不但自身具有较复杂的调控机制，而且彼此相互联系、相互影响，从而组成了一个更复杂而精细的调控网络，共同参与白藜芦醇的调控作用。

1.NF-κB炎症信号转导通路

核因子κB（nuclear factor-κB）是一类炎症相关的转录因子，广泛存在于真核细胞内，与炎症反应的发生发展过程密切相关。NF-κB 被证实可以诱导多种细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 等）、趋化因子、粘附分子以及各种炎症相关的酶类持续表达，趋化炎性细胞浸润，引起炎症反应[32，33]。同时上述炎性因子又可以活化NF-κB，进一步放大炎症反应。白藜芦醇可以通过抑制NF-κB 来发挥抗炎效应[7]。Capiralla 等[11]细胞实验发现白藜芦醇可以通过干扰IKK 和IκB 的磷酸化来抑制LPS 引起的NF-κB活化。另有研究表明白藜芦醇可以作用在TLR-4/MyD88/NF-κB 信号通路，减轻软骨细胞的炎症反应[10]。白藜芦醇的衍生物也被证明可以减少LPS 引起的NF-κB 核移位[34]。

2.SIRT1信号转导通路

SIRT1 是组蛋白去乙酰化酶，可以通过减少炎性因子的产生及减轻细胞的病理损伤直接抑制炎症，也可以通过抑制下游信号通路（NF-κB、p38MAPK 等）来间接抑制炎症[35]。白藜芦醇是SIRT1的天然激动剂，早在2003年就被证明其可以直接提高细胞内SIRT1 活性，发挥抗肿瘤、抗炎等作用[36]。Pan[37]的细胞实验中，TNF-α 诱导细胞损伤，白藜芦醇作用后激活SIRT1，抑制NF-κB 及p38MAPK 表达，从而发挥保护细胞的作用。另几项动物实验表明白藜芦醇可以激活SIRT1 来缓解败血症小鼠模型急性肾损伤及心肌损伤症状，选择性抑制SIRT1之后白藜芦醇对小鼠的保护作用也被抑制了[38，39]。除此之外，白藜芦醇可以通过上调SIRT1 蛋白表达，降低P.e-LPS 刺激的成骨细胞中NF-κB 的转录活性，从而抑制NF-κBp65 亚基与MMP-13 启动子结合，从而降低成骨细胞MMP-13 的表达[5]。最近有研究发现白藜芦醇也可以通过抑制cAMP 磷酸二酯酶间接激活SIRT1[40]。在Sadeghi[41]的细胞实验中，白藜芦醇减轻氧化应激并抑制JNK-NF-κB 信号通路的作用不依赖于SIRT1。白藜芦醇与SIRT1 的关系还需要进一步研究。

3.p38MAPK信号转导通路

p38MAPK 是一种分子量约为38KD 的蛋白激酶，磷酸化后核移位，作用于多种转录因子，调节TNF-α、IL-1、IL-6等多种细胞因子表达，引起炎症反应。p38MAPK与根尖周炎的发生发展也有着密切关系[42]。白藜芦醇与p38MAPK 信号通路的关系研究较少。Bi[43]等人发现白藜芦醇可以抑制LPS 诱导的p38MAPK 磷酸化，减少TNF-α 等炎性因子的产生，从而抑制炎症反应。其他两个实验[7，37]证明白藜芦醇可以下调p38MAPK 活性起到保护细胞的作用。

除上述炎症信号转导通路之外，白藜芦醇还与JAK/STAT、AMPK、SOCS-1、SOCS-3 等多种炎症相关信号通路有关[7，44，45]。白藜芦醇的抗炎作用及作用机制还需不断的研究。