紫花苜蓿的皂苷研究

罗 雯，王 丹，边佳辉，孙占敏，唐益雄，吴燕民

（1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 / 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种优质多年生豆科牧草，其草产量高、适口性好，为家畜所喜食，且具有广泛的适应性。在我国的种植面积约450万hm2，主要分布于东北、华北和西北地区[1]。紫花苜蓿营养丰富，蛋白质含量居牧草首位，在农业经济和畜牧业中扮演着重要的角色[2]。苜蓿不仅是优质的青贮饲料，同时也可直接放牧，而且还能有效提高土壤肥力常被用于土壤的生物修复等诸多方面。

紫花苜蓿富含多种植物次生代谢产物，包括皂苷、黄酮、叶蛋白、多糖等[3]。其中苜蓿皂苷是一种重要的活性物质，不仅能调节脂类代谢，降低胆固醇，还具有抗氧化、抗肿瘤等功能[3]。20世纪50年代，国外一些研究者对苜蓿皂苷进行了提取及分离，并进一步分析了其结构及生物功能。对于苜蓿皂苷合成途径的研究已经很多，但分子水平的研究依然不是很清楚。苜蓿皂苷为五环三萜烯类化合物，其合成途径是以2个法尼基焦磷酸(FPP)缩合生成鲨烯通过甲羟戊酸途径和甲基赤藓糖醇磷酸途径合成[4]。目前已经从紫花苜蓿中克隆出了皂苷合成控制基因法尼基二磷酸合成酶基 因 FPPS (farnesyl diphosphate synthase)、GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase)、IPI (isopentenyl diphosphate isomerase)[5]。紫花苜蓿皂苷的研究目前处于起步阶段，通过对其基本性质和提取、分离的研究，可以对农业生产和医疗等行业发展提供理论依据。

1 苜蓿皂苷的理化性质

皂苷(saponin)又名皂甙、皂角苷。皂苷是存在于多种植物物种中结构多样化的一类化合物，其特征为具有结合了糖配基的前体氧化角鲨烯衍生的C30骨架[6]。由皂苷元与糖基、糖醛酸或其他有机酸组成，通常被分为三萜类皂苷和甾体皂苷，也可以分为三萜类皂苷、螺甾醇皂苷和呋喃甾醇皂苷[7]。主要分布于陆地高等植物中，也少量存在于海星和海参等海洋生物中。许多中草药如人参(Panax ginseng)、 远 志 (Polygala tenuifolia)、 桔 梗(Platycodon grandiflorus)、甘草 (Glycyrrhiza uralensis)、知母(Anemarrhena asphodeloides)和柴胡(Radix bupleuri)等的主要有效成分都含有皂苷。

苜蓿皂苷(alfalfa saponin)是从紫花苜蓿中提取的一种多功能生物活性物质，其水溶液振荡时容易产生与肥皂相似蜂窝状的泡沫，因此被称作皂苷。苜蓿皂苷结构可分解为皂苷元与糖配基，其中皂苷元具有亲脂性，糖配基具有亲水性[8]。因其同时具有两性，多为无定形白色粉末，少数呈结晶状，如常春藤(Hedera nepalensis)皂苷为针状结晶；多具有吸湿性，味苦，皂苷的溶解度根据其分子中结合糖基的数目而有不同。一般可溶于水，易溶于热水、热甲醇及热乙醇，不溶于极性小的有机溶剂(如乙醚等)。苜蓿皂苷结构较复杂，主要由糖中羟基或非糖类化合物的羟基以缩醛链脱水缩合而成的环状缩醛物[9]，均为齐墩果烷(oleanane)型五环三萜烯类化合物(图1)。第3位均为β构型的羟基或苷化，第28位多连接羧基并且常苷化，第23、24位多羟基化或羧基化，糖部分主要为葡萄糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、芹菜糖、半乳糖等[10]。Bialy等[11]从苜蓿根中分离鉴定出24种皂苷，分别为13种苜蓿酸(medicagenic acid)、2 种 Zanhic acid、4 种常春藤皂苷元(hederagenin)、1种大豆皂醇A(soyasapogenol A)、2 种大豆皂醇 B(soyasapogenol B)、1 种大豆皂醇 C(soyasapogenol C)和1 种 贝 萼 皂 苷(bayogenin glycoside)。

图1 三萜皂苷结构Figure 1 Structure of triterpenoid saponins

2 苜蓿皂苷的分布及含量

苜蓿皂苷在苜蓿植物体内各个组织均有分布，包括根、茎、叶等，种子中也含有皂苷。张俏燕等[12]以中苜1号为研究对象测定各个组织中总皂苷的含量，发现中苜1号中皂苷含量表现为根 ＞ 叶 ＞茎，种子中总皂苷含量与茎接近。Nowacka和Oleszek[13]利用液相色谱技术分析苜蓿中皂苷含量时发现，紫花苜蓿地下部分皂苷含量显著高于地上部分。根据已发表的文献数据[14]显示，紫花苜蓿不同组织中皂苷含量大致趋势为根 ＞ 叶 ＞ 茎。也有报道指出，苜蓿各个组织中叶的皂苷含量极显著高于根和茎部，而根部的皂苷含量高于茎[15]。紫花苜蓿不同品种间总皂苷含量不同，同一品种各个组织中皂苷含量也存在差异，有报道[16]证实同一苜蓿品种相同组织在不同生长阶段中的苜蓿皂苷含量并非稳定不变。张吉明等[17]比较不同苜蓿品种、刈割时期及不同青贮添加剂处理紫花苜蓿时总皂苷的含量，发现不同苜蓿品种间总皂苷含量差异极显著(P＜0.01)，总皂苷含量范围为0.69%～0.98%；第2茬不同生育期比第1茬相应时期皂苷含量都有增加趋势，不同生育期以现蕾期含量最高；青贮苜蓿中添加蔗糖和绿汁能够极显著(P ＜0.01)提高苜蓿中皂苷含量；青贮苜蓿皂苷含量也显著 (P＜0.01)高于鲜草。Jin[15]通过比较黄花苜蓿(M. falcate)、天蓝苜蓿(M. lupulina)和紫花苜蓿间皂苷含量及分布状况，发现根部皂苷含量高于茎叶，紫花苜蓿皂苷含量高于其他两种。皂苷在不同属间和品种间的动态变化各不相同，在不同组织中的分布也不同，在9种豆科牧草整个生育时期，均表现为叶片中的含量高于茎秆中的；紫花苜蓿的总皂苷含量高于小冠花(Coronilla varia)和百脉根(Lotus corniculatus)，是提取皂苷的优质材料[18]。沈静等[19]通过丙酮沉淀法提取了7种豆科牧草中的皂苷，研究发现小冠花的皂苷含量最高，紫花苜蓿甘农3号次之，百脉根皂苷含量最低。

紫花苜蓿中含有丰富的皂苷，测定其含量的方法包括比色法、溶血法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等[20-21]。

比色法：由于苜蓿皂苷的结构复杂性，一般对其含量进行检测时需要先进行水解处理，以消除可溶性糖和酚类化合物对测定结果的影响。吴芳等[22]发现，香草醛-高氯酸显色法抗干扰能力较香草醛-浓硫酸显色法及Libemann-Bruchard显色法强。

溶血法：苜蓿皂苷具有溶血性，根据其导致红细胞破裂的能力来测定苜蓿皂苷的含量。Oleszek[23]使用不同方法(溶血指数测试和溶血微量测定法)检测了几种不同的苜蓿皂苷溶血活性，结果表明，皂苷结构及检测方法不同都会导致所得结果的不同。

薄层色谱法(TLC)：设置标准品，在测定之前需要绘制标准曲线，在薄层上通过多次吸附-解吸附的方法来达到分离的目的，进而对待检测物质进行定量分析。许舒雯等[24]利用快速薄层扫描法对苜蓿总皂苷含量进行了测定。测定过程简单快捷，结果也相对较准确。

高效液相色谱法(HPLC)：Huhman和Sumner[25]通过优化后的HPLC耦合电喷雾离子阱质谱方法从紫花苜蓿和蒺藜苜蓿叶片中分离鉴定出了三萜皂苷，其中从紫花苜蓿中鉴定出15种。

以上为4种常见的苜蓿皂苷含量检测方法，各有特点(表1)，目前应用较广泛的方法为高效液相色谱法。

表1 4种苜蓿皂苷定量检测方法的对比Table 1 Comparison of four quantitative detection methods for alfalfa saponins

3 苜蓿皂苷的提取及分离技术

3.1 苜蓿皂苷的提取

较为常用的苜蓿皂苷提取方法有有机溶剂沉淀法、正丁醇提取法、物理辅助提取法和微生物酵解法[28-29]。

有机溶剂沉淀法：利用皂苷在甲醇、乙醇中的溶解度大，在丙酮、乙醚中的溶解度小这一化学性质，首先用乙醇提取，紧接着在醇溶液中加入丙酮，可以使皂苷析出沉淀[28-31]。

正丁醇提取法：适用于提取各类植物的皂苷。该方法利用皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度较大，且能与水分成两相的性质，将皂苷从水饱和的丁醇或戊醇提取出来，从而与亲水性大的糖和蛋白质等分离开来[32]。

物理辅助提取法：利用了超声波的强烈振动和空化效应的提取方法可以得到更理想的提取物[33]。

微生物酵解法：由于苜蓿皂苷在植物细胞壁木质素的包裹下难以降解，所以极大的影响了皂苷的提取。通过微生物法筛选出了分解木质素能力较强的杂色云芝，漆酶作为杂色云芝的分泌物，可分解人参提取人参皂甙[34]。

苜蓿皂苷的提取工艺发展迅速，方法非常丰富，不同需求选择的方法不同，列举出应用较多的4种提取方法的优缺点(表2)。

表2 4种苜蓿皂苷提取方法的对比Table 2 Comparison of four methods of extracting saponins from alfalfa

3.2 苜蓿皂苷的分离

常用的苜蓿皂苷分离的方法有大孔吸附树脂法、高速逆流色谱法、分段沉淀法、泡沫分离法[35]。

大孔吸附树脂法：其原理是由其本身多孔性结构所决定的，是一种吸附性与筛选性原理相结合的分离材料[36]。

高速逆流色谱法：窦德强等[37]用展开剂对分离组进行了薄层色谱(TLC)鉴定，结果表明，分离得到了纯度较好且重现性好的人参皂苷Re及Rg1。该方法是一种不用任何固体载体或支撑体的液液分配色谱技术，其分离效率高，得到的提取纯度大，不存在对样品的吸附和污染。也就是说在试验过程中样品几乎无损失，适用于制备性提取[36]。

分段沉淀法：利用皂苷难溶于乙醚、丙酮的特性。苏永昌等[38]采取了将粗皂苷溶于少量甲醇或乙醇中，然后逐滴加入乙醚、丙酮或乙醚-丙酮的混合溶剂，开始析出含杂质较多的沉淀物质，再继续加入乙醚可得到纯度较高的皂苷。

泡沫分离法：用正丁醇与乙酸乙酯作浮选溶剂，动态泡沫浮选法对二醇型人参皂苷具有很好的富集效果，所以采用泡沫分离法中的动态泡沫浮选法，其回收率均大于90%[39]。操作过程中将原料液加入分离塔中，塔底通气；富集得到的泡沫由塔顶排入贮槽，贮槽中的泡沫自然破裂后收集，经泡沫分离得到的残留液由塔顶倒出，从而得到泡沫液中竹节参总皂苷[40]。

苜蓿皂苷分离技术的研究已经相当成熟，列举了4种分离技术的优缺点(表3)。

4 苜蓿皂苷的应用

4.1 调节脂类代谢，降低胆固醇

动物体内胆固醇来源分为两个部分：一部分是来源于日常摄入的食物中，另一部分(也是最主要的部分)由肝脏合成[41]。Oleszek[42]认为苜蓿皂苷通过减低饲料适口性或降低消化吸收能力的途径对单胃动物产生有害作用。苜蓿皂苷可以通过调节机体内脂类代谢从而降低胆固醇的含量。大量试验证明，适量在单胃动物日粮中添加苜蓿皂苷是有益于动物生长的。雒爱玲[43]在肉鸡仔日粮中添加苜蓿皂苷，0.08%的添加量效果最好，能有效改善肉仔鸡脂质代谢，有效地减少肝脏胆固醇的合成，能影响或阻断胆汁酸的肠肝循环。给健康的Hailanhe蛋鸡日粮中添加苜蓿皂苷，发现鸡蛋中蛋黄胆固醇和蛋白胆固醇无显著变化[44]。邴飞虹等[45]在给大鼠饲喂高脂饲料后在其饲料中添加苜蓿皂苷，证明了苜蓿皂苷能够明显降低低密度脂蛋白(LDL-C)从而降低血清中总胆固醇(TC)含量。苜蓿皂苷还可有效降低高血脂白鼠血管中低密度脂蛋白的含量[46]。对灵长类动物也同样有降低胆固醇的作用，Malinow等[47]对8只食蟹猴(Macaca fascicularis)进行胆固醇的测定，发现在饲喂了苜蓿皂苷后虽然其体内高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)含量没有变化，但总胆固醇含量降低了，因此得出苜蓿皂苷在食蟹猴体内降低了胆固醇的肠吸收，增加了内源性和外源性中性类固醇和胆汁酸随粪便排出的量，并降低了粪便中脱氧胆酸和石胆酸的百分比。虽然苜蓿皂苷在临床上的研究与应用不多，但在一些国家苜蓿已经被做成蔬菜沙拉、药片或果汁的形式，用于降低血清胆固醇。

表3 4种苜蓿皂苷分离方法的对比Table 3 Comparison of four methods for the separation of alfalfa saponins

4.2 具有抗氧化、抗肿瘤的功能

人体衰老、癌症的发生或其他病变都与氧化作用有密切的联系，氧化产生的自由基是衰老的“罪魁祸首”。苜蓿皂苷具有抗氧化的功效，其作用机理包括减少自由基合成的原料及增加分解自由基的酶类物质[48]。张勇[49]在研究中发现，肉仔鸡日粮中添加苜蓿皂苷，血清和肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH- Px)都有不同水平的提高，丙二醛(MDA)水平降低，在一定程度上保护了机体免受脂质过氧化物的损伤，增强了机体抗氧化能力。近期有研究发现，苜蓿皂苷纯化物有潜力作为消除人体宫颈细胞(HeLa)和乳腺腺癌细胞(MCF-7)的抗癌剂或抗癌剂的引导剂，将苜蓿皂苷与抗癌金属顺氯氨铂结合，发现其对人类结肠癌的抑制效果明显增强[50]。苜蓿中提取的皂苷在试验中用来验证其抗癌特性的研究并不多，但其他植物中三萜皂苷的抗癌功能已经通过多方面的验证。

4.3 具有抑菌、杀虫的作用

皂苷需要与胆固醇相结合才能发挥其抑菌作用，通过与细胞膜上的麦角固醇结合破坏细胞膜上结构，增大细胞膜渗透性，从而抑制菌类生长[51]。Jurzysta和Waller[52]以模式真菌—绿色木霉菌(Trichoderma viride)为研究对象证明了在培养基中添加极低浓度的苜蓿皂苷即可完全抑制其生长。在培养基中加入不同浓度从紫花苜蓿中提取的苜蓿皂苷研究7种真菌的生长速度，结果表明添加浓度为 1 mg·mL-1时对真菌生长抑制效果最明显[53]。李波等[54]通过测定7种菌(包括细菌和真菌)在苜蓿皂苷提取液中的活性，发现皂苷对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌具有抑制作用。

从生态学角度来看，植物次生代谢物的出现和分布可能与植物对食草动物的防御策略有关。为了限制微生物，昆虫或脊椎动物捕食造成的损害，植物已经开发出复杂的代谢途径来产生与防治害虫和病原体相关的特定的次生化合物[55]。皂苷对昆虫具有毒性作用，表明其具有保护植物免受昆虫啃食的作用[56]。在灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)幼虫时期喂食苜蓿皂苷，造成其幼虫期及蛹期延长，延缓生长，死亡率增加并且繁殖力降低，这些影响中至少有一部分可能是由于食物滞留时间延长而引起的消化问题[57]。从紫花苜蓿叶中提取皂苷混合物研究其杀虫活性，结果表明，葡萄蛾(Lobesia botrana) 幼虫的死亡率随着饲料中皂苷含量的增加而增加[58]。虫害是限制我国苜蓿产业发展的主要原因之一[59]，因此研究苜蓿皂苷的杀虫特性具有重要的现实意义。

4.4 对反刍动物的影响

紫花苜蓿因其营养全面、适口性好等优势已经成为了现代畜牧业不可缺少的部分[60]。从苜蓿中提取苜蓿皂苷注入成年阉割了的绵羊瘤胃中，保持其瘤胃及十二指肠中含有等能量的饲粮，结果表明，添加苜蓿皂苷能够有效降低瘤胃微生物的发酵和氮素的降解，瘤胃内原虫数量减少[61]。张建刚等[62]对山羊进行了体外瘤胃微生物发酵试验，发现瘤胃细菌培养液在添加皂苷后挥发性脂肪酸含量升高，pH较对照组低。王雅倩等[63]对山羊瘤胃微生物进行体外试验，通过添加适量的苜蓿皂苷可以有效提高瘤胃内酸性物质含量，提高消化率，改善瘤胃发酵环境。Liu等[64]选取50只公羔羊在日粮中添加苜蓿皂苷，90 d后发现添加苜蓿皂苷对羔羊的平均日增重没有影响，随着苜蓿皂苷剂量的增加，养分消化率逐渐增加。对反刍动物进行放牧管理时家畜在大量采食苜蓿后容易引起臌胀病，引起臌胀病的原因为苜蓿皂苷在反刍动物瘤胃内含量过高[65]。目前引起鼓胀病的机理还没有研究清楚，因此在反刍动物的饲养过程中需要注意日粮的精粗搭配[66]。

4.5 其他作用

豆科植物根瘤菌具有植物固氮的功能，大田农耕经常会选择豆科植物与其他作物轮作或将豆科植物与其他植物种精选混播，但这种处理方式并没有能够提高其产量，有研究证明可能是苜蓿皂苷的化感作用造成的[67]。化感作用是指植物产生的次生代谢产物抑制或促进其他植物的生长和发育[68]。可以将苜蓿作为伴生作物，或是利用苜蓿残茬等手段来控制田间的恶性杂草蒲公英(Taraxacum mongolicum)、 白 茅 (Imperata cylindrica)、 野 苋菜(Amaranthus blitum)等[69]。血鹦鹉鱼作为一种观赏鱼类，因其独特的花纹而著名，苜蓿皂苷能够促进其对虾青素的吸收，从而改善鱼体的色泽等指标提高市场价值[70]。

5 苜蓿皂苷的应用前景及展望

随着人类社会的发展，越来越多的人开始追求绿色、有机、健康的生活。紫花苜蓿是一种可持续利用的绿色资源，而苜蓿皂苷作为一种纯天然的植物次生代谢物质，具有多种功能，因此具有良好的应用前景[71]。

首先，紫花苜蓿是营养价值最高的牧草之一，在动物饲料方面的应用很广泛，苜蓿皂苷可以作为一种天然的饲料添加物，以增加家畜对饲料的消化率，保持营养平衡[64]；促进家禽脂质代谢，在生产低胆固醇肉鸡及鸡蛋方面可以开发利用[72]。其次，苜蓿皂苷能够有效降低动物体内胆固醇含量，在医药方面可以用作研制治疗心血管以及动脉粥样硬化等疾病的药物[73]。近年来，苜蓿皂苷被发现对于部分肿瘤、癌症具有有益的作用，未来在开发抗癌药物时是一个很好的切入点；苜蓿皂苷除了在动物生产及医药方面具有重要的作用以外，在大田病虫害防止以及化妆品行业均具有良好的利用价值。苜蓿皂苷可以作为一种低毒农药，在防止病虫害方面发挥作用。抗氧化是目前化妆品研发的最热门方向之一，苜蓿皂苷具有一定的抗氧化功能[74]，又可以直接从植物中提取，因此在研制纯天然绿色的护肤品过程中可以发挥重要作用。

目前市面上皂苷含量较高的苜蓿品种包括阿尔冈金、甘农3号、新疆大叶等[75]，皂苷具有多种多样的生物学功能，因此培育皂苷含量高的苜蓿品种也将成为热门研究。