盘基网柄菌的趋电性和趋化性研究

韵金磊

（云南师范大学 生命科学学院，云南昆明 650500）

1 模式生物盘基网柄菌

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）已被选为真核趋向性运动研究的关键模式生物，对这种低等真核生物的研究能够观测真核趋化性和趋电性行为并逐渐了解其机制。盘基网柄菌生活在富含有机物的土壤中，在大部分生命周期中是独立的细胞进行有丝分裂，当外界营养匮乏时可以进行无性繁殖，细胞向周围分泌环腺苷酸（cAMP），细胞会感知cAMP并汇聚移动，此时细胞还会分泌糖蛋白使多个细胞可以黏附到一起，多达百万的细胞汇集在一起，形成一个“细胞堆”，这个“细胞堆”从尖端延长形成“蛞蝓体”，在感受温度和光线以后最终形成由基盘、茎和孢子囊组成的子实体。子实体形成过程中，大约20%的细胞会死亡，属于一种利他主义，此时会形成孢子囊，继而释放孢子；当环境改善时，孢子会变成单倍体细胞进行营养生殖[1]。一般来说，盘基网柄菌通常无性繁殖，但如果满足某些条件，也能够有性繁殖。由于信号转导的进化保守性，盘基网柄菌细胞的许多信号分子可以在哺乳动物细胞中找到同源物，研究这个简单生物体可以指导真核生物趋向性研究的方向，如感受环境（化学引诱物或电场方向）的分子成分以及细胞内信号传递的基本通路[2]。

2 趋化性和趋电性研究进展

2.1 趋化性的信号转导研究

在营养缺乏期间，盘基网柄菌细胞进入孢子形成的发育阶段。在此过程中，细胞趋化性趋向于分泌的cAMP，导致细胞分化并聚集成由基盘、茎和孢子囊组成的子实体[1]。当cAMP结合G蛋白偶联受体（GPCR）cAMP受体1（CAR1）时，开始趋化迁移。这首先导致G蛋白解离为Gα和Gβγ亚基，然后激活多种信号级联通路以极化细胞，极化是细胞迁移的先决条件[3]。细胞极化伴随着细胞骨架的重新分布成分，运动前端富含被激活的F-肌动蛋白和许多肌动蛋白结合蛋白，肌球蛋白Ⅱ组装在侧面和背面 。这些高度精确的分子活动导致盘基网柄菌可以用超过20μm/min的速度变形虫式迁移[4]。

PIP3的不对称分布是由于细胞前端的PI3K激活，以及侧面和后面PTEN的空间激活[5]。此外，PIP3是非常强的伪足扩张诱导物，如敲除pten的突变体拥有更高的PIP3水平，以及更多的伪足[6]。钙离子的扩散是比较缓慢的，盘基网柄菌存在细胞外钙调蛋白并且有助于趋化性，也有研究指出Ca2+信号并不会直接影响细胞的趋化性，但是会调节PI3K和PLA2的活性[7-8]。PIP3的上游主要由两个途径介导——PI3K和PLA2，抑制了PI3K对盘基网柄菌的趋化性仅具有中等作用。PLC途径通过PIP2/PTEN调节PI3K；PLA2途径取决于细胞内Ca2+，其受IP3、脂肪酸和Ca2+摄取调节。这些交织和部分冗余的信号级联使盘基网柄菌的趋化性非常强，因而必须抑制多个信号路径才能使趋化性强烈减少[7]。这些定位的PIP3信号，为下游级联的含PH域蛋白质提供空间定位，进而在趋化运动中形成空间的肌动蛋白组装体[9]。

丝裂原活化蛋白（MAP）激酶级联是真核生物保守的信号转导途径。MAP激酶DdERK2对于盘基网柄菌响应cAMP和叶酸的趋化性具有关键作用，其活性在化学引诱物刺激后15～60 s达到峰值。破坏DdERK2的下游EppA基因会导致发育延迟并降低细胞对cAMP和叶酸的趋化反应。而且EppA也是细胞内cAMP积累所需，显示了DdERK2-EppA信号调节盘基网柄菌的趋化性[10]。

H+的外排被认为是细胞运动期间细胞骨架和形态学极化的保守机制。在盘基网柄菌中，细胞内pH对定向运动的信号传导起关键作用。Na-H交换泵在盘基网柄菌中会定位到运动的前端，并且是细胞内pH稳态和趋化运动的必要条件。当敲除该离子泵以后，细胞依然能够感知cAMP，但是细胞极化会受损，运动速度降低，错误定位的伪足延伸，以及前沿的F-肌动蛋白聚集显著减少，但是PI（3，4，5）P3在前端的聚集增强。总之，Na-H交换泵是F-肌动蛋白聚合以及细胞极化所需要的[11]。另外，piaA是化学引诱物受体以及G蛋白介导的活化作用所需要的，piaA敲除细胞表现出弱的趋化性和弱的敏感性，piaA-细胞聚集不足，可能是因为它们不会产生细胞间cAMP信号[12]。

2.2 趋电性的信号传递研究

对盘基网柄菌趋电性缺陷株的大规模基因筛选结果显示，PiaA或TORC2复合物的其他成分以及其上游调节物和下游底物在趋电性信号级联中有重要作用。利用同源重组破坏掉piaA基因以后，盘基网柄菌显示出严重的趋电性缺陷，方向性（运动方向与诱导方向夹角的余弦值）仅有0.24左右（野生型约0.8）。而且在不同强度电压下，piaA-细胞都表现出了显著的趋电性下降，重新表达piaA基因以后，趋电性得到恢复。TORC2在细胞的前缘被激活，在那里它引起PKB的局部活化和PKB底物的磷酸化。在趋化性中，RasC及其上游激活因子-鸟嘌呤核苷酸交换因子GefA，是TORC2的上游。TORC2的另外两个组分，Lst8和Rip3也在趋化性中起作用。此外，敲低Rictor，PiaA的哺乳动物直系同源物，抑制中性粒细胞趋化性。破坏gefA、rasC、rip3、lst8、pkbA和pkbR1会在不同程度上抑制趋电性[13]。与piaA-细胞相似，rip3-细胞指向性以及迁移速度大幅下降。缺失菌株lst8-和pkbA-表现了不太明显的趋电缺陷，而pkbR1缺乏对趋电性有更显着的影响[14]。

对于缺乏TORC2、PI3K或PLA2的盘基网柄菌突变体的研究显示，piaA-细胞的方向性便显出最明显降低（大约是野生型细胞24%），用PI3K抑制剂LY294002处理的细胞也明显降低了方向性（大约为对照组的56%），缺乏PI3K1和PI3K2（pi3k1-2-）的菌株与LY294002处理的效果一致，pi3k1-2-细胞显示出显著降低的趋电性。然而pla2-细胞显示出与野生型AX2细胞相当的趋电反应[15]。

3 盘基网柄菌趋电性和趋化性的异同

3.1 G蛋白偶联受体

盘基网柄菌的趋化性是由G蛋白偶联受体介导的，虽然不同的化学引诱物会使用不同的受体和Gα亚基，但是Gβ亚基是细胞响应所有化学引诱物所必需的。在外加直流电场中盘基网柄菌表现出惊人的趋电性，cAMP诱导的趋化运动方向性达到0.8，趋电运动的方向性与趋化运动没有显著差异 。然而敲除Gβ、cAMP受体和Gα2的细胞依然存在趋电性，尽管无Gβ趋电性会减弱。而这些蛋白在趋化性中是必需的，会在细胞前端被激活，显然在趋电性中不存在这些蛋白的空间激活。另一方面，在细胞趋电运动中F-肌动蛋白依然会像趋化运动一样聚集在细胞前沿，因此细胞趋电性的信号感知传递是独立于G蛋白偶联受体信号路径的，而G蛋白的下游调控细胞骨架的部分趋电性与趋化性很有可能出现交叉 。

3.2 TORC2与PIP3途径

TORC2途径与PIP3平行介导趋化反应。PI3K和PLA2两个途径是趋化性中介导PIP3的主要上游 。然而在盘基网柄菌细胞趋电性中，TORC2和PI3K的缺失会导致趋电反应的下降，而PLA2的缺失却不会影响趋电性。TORC2上游的RasC和GefA，TORC2的组件PiaA，Lst8和Rip3，以及下游的PKB既参与盘基网柄菌趋化反应也参与趋电反应。PI3K在趋电性和趋化性中也发挥重要作用。然而在细胞趋化性中PIP3上游之一的PLA2途径并没有参与盘基网柄菌的趋电性。

3.3 细胞膜电位

有研究显示，细胞外pH值、[K+]和电穿孔均显著影响趋电性，这些变化可能通过介导细胞膜电位（Vm）发挥作用。使用三个独立因子来控制Vm（细胞外pH，细胞外[K+]和电穿孔），研究盘基网柄细胞耐受剧烈Vm变化的能力，以及研究Vm在趋电性和趋化性中的作用，用微电极记录技术监测Vm的变化。在酸性（pH 5.0）和碱性（pH 9.0）条件下以及在更高的细胞外[K+]条件下观察到去极化的Vm。电穿孔显著降低细胞膜Vm，超过40min才逐渐恢复。其结果发现Vm降低显著减弱趋电性，并没有显著影响随机运动或趋化性。因此，趋电性可以通过Vm的变化来调节，趋电性的定向传感机制不同于趋化性[16]。

4 讨论与展望

本文比较了盘基网柄菌细胞的趋电性和趋化性。其在信号传导机制方面还是有很多差异的，比如对于趋化性非常重要的cAMP受体和Gα、Gβ亚基，敲除以后细胞依然存在趋电性，因此趋电性是独立于G蛋白偶联受体途径的。在细胞趋化性中PIP3的上游之一PLA2，敲除以后并不会影响趋电性。而细胞膜电位的变化会显著影响细胞的趋电性，不会显著影响细胞的趋化性和随机运动，显示了细胞趋电性和趋化性定向机制的不同。另外，不同于盘基网柄菌对cAMP的响应，发育阶段对于趋电性不是必要的，说明了趋电性不依赖细胞发育过程中特殊表达的基因。虽然在信号传递的上游存在许多差异，但是细胞趋电和趋化运动F-肌动蛋白都会聚集并被激活在细胞定向运动的前端，说明调控细胞骨架的部分很可能出现交叉。研究结果也显示，比如PI3K-PTEN、TORC2上游的RasC和GefA、TORC2的组件PiaA、Lst8和Rip3以及下游的PKB，这些分子共同参与了盘基网柄菌的趋电性和趋化性。

盘基网柄菌作为研究真核生物趋向性的模式物种，对其趋化性的研究是比较透彻的，而对于趋电性的研究虽然取得了比较大的进展，但是依然比较缺失，细胞感知电场的机制也并不明确，而且研究切入点也主要是趋化性的相关分子。由于细胞趋电性在胚胎发育，组织再生和伤口愈合的重要调控作用，以及在临床治疗方面存在的巨大潜力，所以对于真核细胞趋电性的研究是非常重要的。总之，对于简单真核模式生物盘基网柄菌趋电性的研究是一个非常好的突破口，对于阐明趋电性生理机制、探索趋电性的应用非常有意义。