尿激酶的质量研究

胡著阳，魏超娟，耿卫锋

（江西浩然生物制药有限公司，江西南昌 330029）

尿激酶是一种糖蛋白，属丝氨酸蛋白酶类，由人肾小管上皮细胞分泌产生，其天然蛋白质底物为纤溶酶原。尿激酶通过催化纤溶酶原而将纤溶酶原激活并转变为纤溶酶，后者可催化不溶性的纤维蛋白（血凝块的主要成分之一）降解成可溶性的碎片，从而起到局部溶栓作用。

尿激酶的研发历程可追溯到20世纪中叶，1947年，Macfarlane首先报告了在人的尿中含有纤溶活性物质，1951年Willama证实了这一活性物质能激活纤溶酶原使其转变为纤溶酶，1952年Sobel发现在人体和一些动物尿中存在有纤溶酶原的激酶，并正式命名为尿激酶（Urokinase），1958年Sokal将其用于临床研究治疗血栓形成性疾患，1933年Johason用尿激酶治疗实验性静脉血栓，证实其在体内具有溶解血栓的作用。我国尿激酶的研究工作开始于20世纪70年代初期，至今以已取得较大进展[1]。

1 尿激酶的药理作用

尿激酶为酶类溶血栓药物，可激活体内纤溶酶原转为纤溶酶，从而水解纤维蛋白使形成的新鲜血栓溶解，其机制为切断溶酶原分子中的精氨酸560-缬氨酸561键，使生成纤溶酶，从而降解纤维蛋白凝块、纤维蛋白原以及前凝血因子Ⅴ和Ⅷ，并分解与血凝有关的纤维蛋白降解产物。

尿激酶直接作用于内源性纤维蛋白溶解系统，能催化裂解纤溶酶原成纤溶酶，后者不仅能降解纤维蛋白凝块，还能降解血循环中的凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅷ和纤维蛋白原等物质，而发挥溶栓作用[2]。尿激酶对新形成的血栓起效快、效果好，还能提高血管ADP酶活性、抑制ADP诱导的血小板聚集、预防血栓形成[3]。该品在静脉滴注后，患者体内纤溶酶活性明显提高，停药几个小时后，纤溶酶活性恢复原水平，但血浆纤维蛋白或纤维蛋白原水平的降低，以及它们的降解产物的增加可持续12～24h，该品显示溶栓效应与药物剂量，给药的时间呈明显的相关性。

2 尿激酶对治疗血栓性疾病的重要性

血栓性疾病是一种常见的心脑血管病，是由血栓引起的血管腔狭窄与闭塞，使主要脏器发生缺血和梗死而引发机能障碍的各种疾病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死和静脉血栓栓塞[4]。血栓性疾病可影响全身各个器官及系统，其发病率、致残率和死亡率都很高。每年约有3‰人发生不同形式的血栓性疾病，严重威胁着人类健康。我国每年死于心脑血管疾病的人数约为300万，存活的患者致残率高。

尿激酶属于溶血栓类药物，是临床上重要的溶栓药物，它是治疗心脑血管和外周血管等处血栓性疾病应用最广泛的药物之一，除了在治疗心脑血管疾病、急性静脉血栓、急性动脉栓塞、急性心肌梗死、急性肺栓塞有广泛应用外，还可用于防治心脏瓣膜替换手术后的血栓形成，下肢深静脉血栓，对动脉阻塞性眼病，突发性耳聋，冠脉血栓，肾病综合征，结核性胸膜炎，结核性腹膜炎，支气管扩张，糖尿病性周围神经病变，糖尿病性周围神经病变，断指再植术后等也有一定的疗效。

与其他常用的溶栓药物相比，尿激酶具有起效快、毒副作用小等特点，小鼠静脉注射半数致死量大于100万国际单位/kg体重，且无明显抗原性、致畸性、致癌性和致突变性，临床上罕有过敏反应的报道。与链激酶相比，尿激酶对人体无抗原性，因此过敏反应的发生率极低；与组织型纤溶酶原激活剂相比，尿激酶的价格适中，且出血的危险性较低。目前，可完全替代尿激酶的只有进口药品“阿替普酶”，二者具有相同溶栓效果，但进口药品的价格是注射用尿激酶的15～20倍。因此，尿激酶在临床治疗血栓性疾病方面具有重要地位。各药品生产企业必须不断提高尿激酶产品质量，对产品质量标准和质控方法作进一步研究。

3 尿激酶的质量标准、关键质量属性及质量标准提高的方向

在我国，尿激酶自1995年起收载自各版本《中国药典》[5]中，经多次修订，质量标准总体呈提高趋势，最新质量标准参见《中国药典》2015年版二部“尿激酶”项。其中对尿激酶的制法要求，性状，鉴别，检查（溶液的澄清度与颜色、干燥失重、分子组分比、乙肝表面抗原、异常毒性、细菌内毒素、凝血质样活性物质），效价测定（酶活力、蛋白含量），类别，贮藏，制剂等都作出了规定。

除《中国药典》外，尿激酶收载于全球各主要现行药典中（欧洲药典EP[6]、日本药局方JP[7]）。表1为现行药典中尿激酶质量标准的比较。

根据表1，现行各版药典中尿激酶的质控指标，各项指标的要求、分析方法各有不同。总体上《中国药典》中尿激酶的质量标准总体高于其他现行药典。

对上述各版现行药典中尿激酶质量标准进行分析可得出，除常规检测项目外，产品的关键质量属性如下。

3.1 分子组分比

该项目中，《中国药典》标准较EP、JP更高。分子组分比是同时影响产品安全性和有效性的关键质量属性之一。尿激酶包含两种分子量形式：54000和33000D[8]。在人体尿液中，尿胃蛋白酶可把尿激酶原切割为具有高生物活性的双链形式天然尿激酶分子。天然尿激酶分子双链通过二硫键连接，为高分子尿激酶（H-uK）[9]。高分子尿激酶为尿激酶中的主要活性成分，其高级结构具有完整的三个模块：N-端的表皮生长因子样模块G(growth factorlike domain)，Kringle模块K和C-末端的蛋白酶模块P。其中G模块主要参与尿激酶与uPAE/CD87受体的结合，C-末端蛋白酶结构域则具有丝氨酸蛋白酶的典型特征，Kringle结构域主要与纤溶酶原激活抑制因子1（PAI1）作用。而尿激酶在实际生产、运输、贮藏的过程中，可能发生水解作用，高分子尿激酶会进一步降解为分子量为33000 D的低分子尿激酶（L-uK）。该种形式尿激酶分子只剩下完整的蛋白酶模块，因此有一定的体外溶栓生物活性，但由于缺少生长因子样模块G和Kringle模块K，在体内的溶栓及以外的作用机制不明确，且具备引发出血等不良反应的可能。

为了更有效地控制药品的安全性和有效性，药品生产企业应致力于优化尿激酶生产工艺中的纯化步骤，进一步提高产品中H-uK组分的占比，设定更高的内控标准，ChP可考虑将提高H-uK分子组分比作为标准提高的方向。

3.2 重金属

目前仅JP包含重金属检测项目。考虑到尿激酶的生产工艺中可能带入包含重金属的试剂，为保证药品的安全性，应加强对原料药重金属含量的控制。

3.3 乙肝表面抗原

《中国药典》及EP对该项目做出规定：乙肝表面抗原应检测结果应为阴性；JP无该项检测指标。

考虑到尿激酶的来源为人体，存在带入病毒的风险，因此在对供尿人员健康状况进行控制及在生产工艺中加入病毒灭活步骤（《中国药典》2015版二部中尿激酶项下【制法要求】）中规定：本品在生产过程中需经60℃加热10小时，以使病毒灭活）外，有必要在质量标准中加入病毒检测的项目进一步保证药品的安全性。目前，《中国药典》已包含乙肝表面抗原检测项目，可考虑将增加丙肝抗体、艾滋抗体等检测项目作为质量标准提高的方向。

3.4 酶活力（效价）/比活

关于比活，各版现行药典中尿激酶质量标准均有规定，《中国药典》及JP标准较EP更高（《中国药典》、JP规定：每1mg蛋白中尿激酶活力不得小于12万单位；EP规定：每1mg蛋白中尿激酶活力不得小于7万单位）。关于酶活力，各版现行药典在检测方法上有所差异，ChP和EP的酶活力测定方法为通过溶栓实验进行测定，JP中的酶活力测定方法为小底物法，原理虽不同，但均采用与标准品进行比对，因此对酶活力的定义相同。除检测方法不同外，JP规定尿激酶单位效价不得低于60000IU/mL，ChP和EP对单位效价（酶活力）未作出规定。

考虑到注射用尿激酶的给药途径为静脉注射，对纯度要求较高，而尿激酶的生产过程特别是纯化步骤中会使用大量的盐溶液，因此在控制产品比活（IU/mg蛋白）的基础上，可对产品中主成分含量进行控制，增加单位效价（IU/mg）的标准。