高效液相色谱电化学发光法检测抗坏血酸的效果研究

2019-02-18朱碧宁

山西化工 2019年3期

朱碧宁

(阳江职业技术学院，广东阳江 529566)

引言

抗坏血酸又称为维生素C是一种已糖醛基酸，广泛地存在于植物的组织中。抗坏血酸也是一种含有六个碳原子的酸性的多羟基化合物，具有很强的还原性，极易被氧化，被广泛地运用于药物、临床治疗、食品以及人体中，是人体中最不可缺少的一种重要的营养物质。抗坏血酸参与了人体内的一系列的代谢及其相关的反应，有利于刺激肾上腺激素的合成，促进了人体的肠道内的吸收以及解毒的作用。常用的测定的抗坏血酸的方法有很多，各种方法均具有自己的独特之处，但是这些方法在样品处理方面比较复杂，所以本文就在恒电流的条件下，利用不稳定的化学发光的试剂直接将抗坏血酸氧化使其产生化学发光并结合高效液相色谱法与电化学发光法，建立了高效液相色谱电化学发光法来检测抗坏血酸。

1 高效液相色谱法以及电化学发光法的原理

第一，高效液相色谱法的原理。高效液相色谱(HPLC)法的原理就是将高压下的液体作为流动相，并且采用颗粒极其细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱法具体的分为分析以及分离[1]。高效液相色谱法的分析原理：高效液相色谱法的分析是利用泵将相关的溶剂吸入到色谱系统中将溶剂吸入进去之后，再将溶剂输出来，经过相关的测量之后，再通过色谱注，进行完分离之后，再次进入到检测器，进行相关的信息采集以及处理，并同时记录下。如果遇到了比较复杂的混合物(极性范围比较宽的)那么就可以采用梯度控制器作为梯度来洗脱[2]。高效液相色谱法的分离原理：高效液相色谱法的分离，是在流动相以及固定相之间将进入色谱柱的溶质进行来回交换。其主要的原理就是因为溶质的不同分配系数或者是不同的分子大小，从而引起流动相以及固定相对溶质不同的阻力作用，这样就使得不同的成分会因为不同的分配系数而以不同的速度流出色谱柱。比如，假设样品中主要含有三种不同成分，A、B以及C，这三种成分进入了色谱柱之后(随着流动相进入)，那些分配系数相对小的成分就会因为不容易被固定相固定住，而比较早地流出了色谱柱的外面。分配系数相对较大的则会在固定相中停留时间较长，会比较晚流出色谱柱[3]。而分配系数在两者之间的则会第二个流出色谱柱。综上所述，如果存在着这样一种物质并进入到色谱柱中，会因为它里面的不同成分的不同分配系数，而呈现出不同的流动速率。这些成分就会以先后不同的顺序流出色谱柱的外面，从而就会达到分离的目的。不同的组成成分在色谱柱中的分离的情况，最主要取决于各种的成分在两相之间的分配系数、吸附的能力以及亲和力是否存在着差异，这就是热力学平衡的问题，同时也是分离的首要条件。其次就是当不同的组成成分在色谱柱中运动的时候，谱带会随着柱长而展宽，分离的情况和两相(固定相、流动相)之间的扩散的系数、固定相颗粒度的大小、色谱柱的填充的情况以及与流动相的流动速度有关。所以分离的效果主要涉及到了热力学与动力学两种方面的综合。

第二，电化学发光法的原理。电化学发光法是一种在电极的表面因为电化学反应而引发的特异性的发光反应，主要包括电化学以及化学发光两部分。在电化学反应的过程中，给工作电极上的阳极加上一定量的电压，在能量的作用下，阳极上就会释放出电子从而发生了相关的氧化反应成为了更高价的金属。在这个电极的表面的电子也会同时会释放电子从而发生了相关的氧化反应，那么这个电子就会成为一种阳离子的自由基，迅速地自发脱去一个质子，形成另一个自由基。在整个的反应体系中就会存在一种极具有强氧化性的离子，以及极具有强还原性的自由基。这两者之间还会发生氧化还原反应，最后的结果就会使高价的离子被还原成激发态的低价离子，能量的来源主要是在于高价的离子以及自由基之间所能够形成的电势差。通过这种循环的过程，测定的信号就会不断被放大，灵敏度也就大大提高了。

2 高效液相色谱电化学发光法检测抗坏血酸的检测方法

第一，仪器与试剂的选择。TCC-UV-260紫外线可见分光光度计、LC-6A高效液相色谱仪、C18柱、SPD-6AV紫外检测器、超微弱发光分析仪、JH2C恒电位仪、电解池、抗坏血酸溶液(0.1 g/L)/MnSO4溶液(1 mol/L)、NH4H2PO4溶液(5.0 g/L)。所有的试剂都为分析纯，所有的水都是二次去离子水。

第二，样品的测定。在选定好的电化学的发光条件以及色谱的条件下，分别对人体的血清以及尿液中的抗坏血酸进行测定，将标准物质的流出的时间当作是定性的依据，然后再用峰高再对抗坏血酸进行定量检测。取人体中的血清、尿液5 mL，分别加入到等体积30 g/L的H3PO4溶液中，当作是VC提取剂，用来防止蛋白质堵塞住了色谱柱，摇匀后静置30 min，提取上层清液，将提取到的上层清液用0.45 μm的色谱过滤膜中过滤，最后再取30 μL进样，这样就用化学发光法检测抗坏血酸得到了色谱图。

第三，流动相的选择。对于流动相的选择应该与电化学发光的检测相适应，所以选择的流动相应该具有以下的条件：具有较好的分离的效果，而且又不能对电化学的试剂有影响(熄灭作用)。经过试验发现5 g/L的NH4H2PO4溶液对于电化学的发光并没有任何影响，并且具有无毒、价格便宜等优点。所以应选择NH4H2PO4溶液作为流动相。

第四，流动相流速的选择。流速对于发光强度有一定影响，流速在0.5 mL/min～2 mL/min的范围内，电化学的发光的强度会随着流速的增大而增大；但当流速大于2 mL/min的时候。电化学的发光强度会随着流速的增大而减小，在考虑到要与高效液相色谱的泵速(1 mL/min)相匹配，而流动相的流速不一样，对所呈现出的色谱峰的展宽也不一样，所以在兼顾了灵敏度以及分离度的条件下，应选择1.0 mL/min的流动相的流速。

第五，电解电流的选择。电解电流也会对发光的强度有所影响，电化学的发光强度会随着电解电流的增大而增大，但当电解的电流大于10 mA的时候，电化学的发光强度会随着电解的电流的增大而减小。这是因为电极的表面会产生气泡，从而影响稳定性，所以应选取电解电流应为10 mA。

第六，实验的方法。在选定好的电化学发光的条件以及色谱的条件下，首先将输液管插到相应的各个溶液中，然后启动蠕动泵、恒电流泵以及高压泵，等到基线稳定以后，用进样器提取VC标准溶液或者是样品溶液再注入到色谱柱中[4]。最后，根据色谱柱的峰高绘制出工作的曲线或者进行定量分析。