基于mtDNA基因序列的北美五倍子蚜遗传多样性

岳拴琴,任竹梅

(山西大学 生命科学学院,山西 太原 030006)

0 引言

五倍子蚜特指寄生在漆树科盐肤木属(Rhus)植物上形成五倍子虫瘿的一类蚜虫,属于昆虫纲半翅目蚜总科绵蚜亚科(Eriosomatinae)五节根蚜族(Fordini),共有6属12种,除北美(加拿大和美国)分布一单属种北美五倍子蚜(Melaphisrhois)外,其余物种都分布在东亚。五倍子具有重要经济价值,在医药上作为传统中药的有效成分,具有敛肺、止汗、涩肠、固精、止血和解毒等作用;在国防化工上是皮革鞣剂、喷气飞机燃料的稳定剂中的重要成分,在食品上可用于食品抗氧化剂、油脂抗氧化剂的制备等[1]。1866年,Fitch[2]报道在北美Virginia采集到Rhusglabra上的虫瘿,并将寄生在其中的蚜虫定名为Byrsocryptarhois,后来诸多学者[3-4]相继对该物种进行了修订和归类。直到1976年,Eastop和Lambers[5]才将该物种确立为M.rhois。随后,许多学者对其进行了系统发育研究,庞雅文等[6]采用形态特征分析结合线粒体DNA(mtDNA)COI基因序列对该种的分类地位和系统发育关系进行了较为系统的研究,发现M.rhois和倍蚜属的关系密切;安淼等[7]测定了五倍子蚜mtDNACOI、tRNA/COII、Cytb基因以及核DNAEF-1α基因部分序列,数据分析结果支持M.rhois起源于东亚,东亚是五倍子的发源地。Hebert[8]采用等位酶分析方法研究采自加拿大安大略和魁北克两个地区34个M.rhois种群的遗传多样性,结果显示M.rhois种群的遗传变异较小,种群间基因交流少;张健等[9]采用mtDNACOI基因序列对M.rhois3个种群的遗传变异进行比较,发现种群间遗传变异较大,有待进行更深层次的系统研究。

遗传多样性是生物长期演化的结果,可以全面反映物种对环境适应能力的大小。遗传多样性本质上是由于遗传物质发生改变导致的,突变是遗传物质发生变化的根本原因,经过长期的自然选择且有一些中性突变通过随机组合整合到基因组中,可产生丰富的遗传多样性[12]。如果一个物种遗传多样性越高,越容易在恶劣环境中生存下来,尤其更有利于扩大该物种的生存环境和增加种群的数量,反之可能有濒危或者灭绝的危险[10-11]。

mtDNA是研究属级及其以下阶元较为理想的DNA片段,其中Cytb基因是一种蛋白质编码基因,是目前功能和结构研究最清楚的基因之一,进化速度较快,已被广泛地应用于分子系统学研究[13]。COI基因是细胞色素C氧化酶的重要组成部分,在线粒体基因中是最保守的,进化速率最慢的已被广泛用于昆虫遗传多样性研究中,分析不同类群的种群遗传变异和分化[14]。为此,本研究以Melaphisrhois为研究对象,测定其mtDNACytb和COI基因部分序列,对其遗传变异和遗传结构进行分析,为更好地保护和合理开发利用这一重要生物资源提供分子生物学遗传资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究所用五倍子蚜实验材料均采自美国自然种群,具体信息见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取和PCR扩增

将一个五倍子蚜个体置于1.5 mL EP管中,加入适量无菌水浸泡至少24 h后采用硅胶离心柱法提取总DNA;PCR扩增mtDNACytb和COI基因部分序列,因COI基因片段较长,我们采用两对引物进行扩增拼接,所用引物均由上海生物工程有限公司合成[15-17]。PCR扩增体系和循环程序参考文献[6]。

1.2.2 测序和数据分析

将扩增产物送至上海生物工程有限生物公司进行双向测序,利用Chromos软件对测得的序列进行观察,用Sequencher4.5[18]参照序列彩图进行人工校对;用Clustal-X v1.83软件[19]对所得序列进行对位排列;利用MEGA5.0[20]计算核苷酸变异率;利用DnaSP5.0软件[21]计算种群间遗传距离和单倍型分布等;Arlequin v3.0.1软件[22]计算种群内和种群间遗传变异,以检测地理种群内和种群间的变异程度;TCS v1.21[23]构建单倍型网络图。

表1 Melaphis rhois种群样本信息及mtDNA Cytb和COI基因单倍型和核苷酸多样性指数

2 结果和分析

2.1 碱基组成及变异

本研究共获得美国五倍子蚜9个种群156个样本的mtDNACytb429 bp和COI基因1 245 bp的序列,序列已经全部提交到GenBank,Cytb基因收录号:MH256861-MH257018,COI基因收录号:MH257019-MH257182。

联合基因序列长1 674 bp,其中保守位点1 482个(占88.5%)、变异位点192个(占11.5%)、简约信息位点162个(占9.7%)、单一信息位点30个(占1.8%),碱基A+T含量比G+C高(为74.7%),其中第3位点A+T的含量与其他位点相比最高(为88.8%),si/sv比为8.61。联和序列碱基组成和变异率见表2。

表2 Melaphis rhois mtDNA Cytb和COI基因联合序列碱基组成和序列变异

2.2 单倍型分布

mtDNACytb和COI基因序列共获得86个单倍型(表1),包括8个共享单倍型和78个独享单倍型,其中单倍型M16和M20分别为阿肯色州和佐治亚州种群所独享,M45为俄亥俄州代顿和纽约州2个种群共享,单倍型M60为纽约州、新罕布什尔州、佛蒙特州3个种群共享,这4个单倍型属于主要的类型,分别占单倍型的5.81%、5.16%、5.16%和7.1%。

2.3 种群遗传变异和遗传结构

五倍子蚜9个自然种群mtDNACytb和COI基因联合序列的单倍型多样性(Hd)指数以及核苷酸多样度(π)统计结果见表1,数据分析显示新罕布什尔州种群单倍型多样性指数最高,阿肯色州种群最低;新泽西州种群核苷酸多样性指数最高,俄亥俄州克利夫兰种群最低。

五倍子蚜9个自然种群mtDNACytb和COI基因联合序列FST值和遗传距离结果见表3。

表3中数据表明:俄亥俄州克利夫兰种群与其余8个种群间的FST值(0.788 39～0.985 55)及遗传距离(0.044～0.057)较高,发现该种群与其它种群相比分化较大。

对五倍子蚜9个种群的mtDNACytb和COI基因联合序列进行AMOVA分析,结果显示种群间的变异为59.53%,种群内的变异为40.47%,种群间的变异高于种群内的变异。

表3 五倍子蚜种群mtDNA Cytb和COI联合基因序列间FST(左下)和遗传距离(右上)

2.4 谱系地理分布格局

构建五倍子蚜种群的mtDNACytb和COI基因单倍型TCS网络图,结果见图1。

从图中可以看出,network中有五大明显的簇群,其中俄亥俄州克利夫兰种群的所有单倍型与俄亥俄州代顿种群的单倍型M15形成一个组;密苏里州种群中单倍型M11单独形成一个组;总体来看剩余种群基本上因寄主植物不同聚成三大簇群,佐治亚州、阿肯色州种群单独成支,俄亥俄州代顿、密苏里州、纽约州、新泽西州、新罕布什尔州、佛蒙特州种群呈一种交叉的分布格局,单倍型M20、M45、M68分别位于三大簇群的中心位置。

五倍子蚜种群的mtDNACytb和COI基因联合序列单倍型歧点分布见图2。

Fig.2 Bifurcation point distribution of Melaphis rhois based on mtDNA Cytb and COI sequences注:虚线为观察值,实线为期望值图2 Melaphis rhois mtDNA Cytb和COI联合基因单倍型歧点分布图

中性检测五倍子蚜mtDNACytb和COI基因联合序列的Tajima’D值(0.912 03)为正(表1),并且单倍型歧点分布呈多峰型,说明M.rhois可能在历史上长期处于动态平衡之中。

3 讨论

遗传多样性中单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π)是衡量物种遗传多样性的重要指标,通常值越大,物种种群遗传多样性越高。在本研究中,五倍子蚜种群总体π值为0.027 00,与角倍蚜(Schlechtendaliachinensis,0.002 70)[24]、肚倍蚜(Kaburagiarhusicola,0.015 15)[25]、倍花蚜(Nurudea.shiraii,0.005 7)和红倍花蚜(Nurudeayanoniella,0.012 6)[26]等相比,核苷酸多样性相对较高,遗传多样性较丰富。估计种群的进化历史通常用单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π),当Hd≥0.5,π<0.5%时,表明种群受瓶颈效应后数量迅速扩张;当Hd≥0.5,π≥0.5%时,表示种群稳定,进化历史悠久;当Hd<0.5,π≥0.5%时,表明种群经历了轻微的瓶颈效应,几乎没有影响到核苷酸变异;当Hd<0.5,π<0.5%时,表明种群近期经历了瓶颈效应[27]。五倍子蚜种群整体的Hd≥0.5,π≥0.5%,说明种群稳定,进化历史悠久,该结果与中性检测结果相吻合,mtDNACytb和COI基因联合序列的中性检测Tajima’D值(0.912 03)为正,单倍型歧点分布呈多峰型,说明五倍子蚜可能在历史上长期处于动态平衡之中[28]。另外,北美五倍子蚜阿肯色州种群的Hd值较高(Hd≥0.5),π值较低(π<0.5),是由于在积累时间上核苷酸多样性比单倍型需要的时间长,说明这些种群是从较小的种群迅速扩张而来[29]。

五倍子蚜因生活环境的不同,而产生不同程度的遗传分化。遗传分化指数FST是衡量种群遗传分化的一个重要指标。通常,FST的理论取值范围应为0～1,FST值越接近0,说明种群间遗传分化程度越小;FST值越接近1,说明种群间遗传分化程度越大;若FST=1.00,则种群间已形成生殖隔离[30]。五倍子蚜俄亥俄州克利夫兰种群与其余8个种群间的FST值(0.788 39～0.985 55)较高,说明该种群与其他种群的分化较大。AMOVA结果表明种群间的变异是遗传变异的主要来源。造成分化的可能原因是种群分布的地理位置不同造成地理隔离,而生殖隔离随地理隔离产生,使得不同地理种群的北美五倍子蚜之间发生分化。

结合TCS网络图发现五倍子蚜种群联合序列86个单倍型形成5个大的聚类簇,而俄亥俄州克利夫兰种群全部单倍型与代顿种群一个单倍型聚为一组;结合种群间的FST值以及遗传距离分析,推测其可能是五倍子蚜的一个新种。

五倍子蚜的种群和样本数量也可能对结果有一定的影响,而且生物的进化是一个极其复杂的过程,应结合形态学、解剖学、古生物学等多种方法进行综合研究。下步研究中,我们将扩大种群的采集范围、增加种群数量和基因序列信息量进行深入探讨。