维生素B12检测方法研究进展

祖新，李潇玲，焦成瑾

（1.甘肃省食品检验研究院，甘肃兰州730030；2.甘肃省功能基因组与分子诊断重点实验室，甘肃兰州730030；3.天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃天水741001）

维生素B12是迄今为止人类发现最晚的一种B族维生素，别名钴胺素、氰钴胺、动物蛋白因子等。维生素B12与人类健康息息相关，它以辅酶形式参与各种代谢过程，促进甲基的形成和转移，参与某些化合物的异构化作用、维持巯基的还原状态，促进DNA和蛋白质的合成，促进细胞的成熟，维持神经组织的正常功能。缺乏VB12不仅会导致贫血，还会引起心脏病、神经紊乱、生育与出生缺陷以及癌症等。作为维持人体正常代谢和机能不可缺少的微量营养素，维生素B12受到了人们越来越多的关注。

1 维生素B12的结构特点和来源

维生素B12是一类含有钴离子的咕啉类化合物总称，呈类八面体结构，主要由以下3个部分组成。首先，其中心4个吡咯（parolee）以4个N原子与中心金属钴离子相连，形成了一个平面咕啉环（corrin ring）；其次，5，6-二甲基苯并咪唑 （5，6-dmiethylbenzmi idazole，DMBI）以N-7原子与钴离子相连成为维生素B12分子的低位配基，同时DMBI通过磷酸基团和氨丙醇（aminopropanol）相连，氨丙醇则与吡咯环上的丙酸侧链通过共价键相连；此外，腺苷（adenosyl group）或甲基（methyl group）与钴离子相连组成维生素B12分子的上位配基；此外，母核中还有9个不对称碳原子。咕啉环轴向上方的配基不同，形成了不同类型的维生素B12类物质。羟基与咕啉环中的钴离子相连形成羟基钴胺（hydroxycobalamin），同样，脱氧腺苷（5′-deoxyadenosyl）、甲基、氰基与钴离子相连分别生成腺苷钴胺（deoxyadenosylcobalamin）、甲基钴胺（methylcobalamin）和氰钴胺（cyanocobalamin）等[1]。维生素B12至少有5种相似结构分子，一般所称维生素B12是指分子中钴和氰（CN）结合的氰钴胺素（cyanocobalamin），维生素 B12在人体内因结合的基团不同，可有多种存在形式，其中甲钴胺素（mecobalamine）和 5′-脱氧腺苷钴胺素（5′-deoxyadenosy lcobalamin），是维生素B12的活性型，也是血液中存在的主要形式[2]。

植物和动物均不能自身合成维生素B12，绝大部分的维生素B12来源是肉类和海产品类，小部分来源于奶蛋及发酵产品。自然界能够产生维生素B12的生物目前发现只有各类微生物如放线菌和细菌，霉菌中的米根霉菌也能合成。动物由于肠道内共生的细菌种类繁多，其中部分细菌（如干酪乳杆菌）具有合成维生素B12的能力，所以在肠道内众多种类细菌的作用下，各类动物能够产生不同水平的维生素B12[3]。

1976年，美国Woodward研究小组和Eschenmoser研究小组合作完成了人类首次维生素B12的全化学合成。由于维生素B12的结构极为复杂，其化学合成高度繁琐且昂贵，从肝脏等动物组织提取的效率和效益也十分低下，所以只能通过微生物发酵法来实现商业化生产。P.shermanii和P.denitrificans是目前工业生产维生素B12的主要生产菌种，蔡莹瀛等[4]采用常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变脱氮假单胞菌（Pseudomonas denitrificans）并从中筛选了高产维生素B12突变株PA320-M4-1B1，在250 mL摇瓶发酵6 d的条件下，维生素B12产量达到（103.2±2.1）mg/L，较初始菌株PA320的（71.9±1.8）mg/L提高了43.8%，且遗传性状稳定。

2 维生素B12检测方法

2.1 液相色谱法

色谱是现代高效分离检测的重要技术平台，伴随现代高效液相色谱的发展，高灵敏度、高分辨率、高通量和自动化等特点使之成为维生素B12检测的优选方法。该方法普遍使用C18色谱柱进行分离，采用三氟乙酸/甲醇[5]、醋酸钠/甲醇[6]、水/乙腈[7]或甲醇/水[8]作为流动相，经梯度洗脱完成维生素B12的分离，联合紫外检测器检测。该方法操作简便、线性范围宽、重复性好，检测限为2.0 μg/mL，适用于药品和血液中的维生素B12检测。

为提高维生素B12的检出限，许多新型前处理方法被开发应用，免疫亲和柱是使用广泛且比较成功的，其净化柱上固定的生物酶可以有效释放样品在净化阶段被结合的维生素B12，从而使食品中的维生素B12得以萃取浓缩，因此检出限普遍可以达到0.01 μg/mL，以适用于婴幼儿乳粉或功能性饮料中维生素B12的测定[9-11]。

Paula等[12]开发的基于亲水离子液体（il）1-己基-3-甲基二氮氯化物，平均萃取效率为97%。只需要5.0 mL的样品和单一的水解、脱蛋白和提取步骤，然后将富含维生素B12的上层相直接注射到高效液相色谱法系统中进行测定，探测极限为0.09 μg/mL，这种绿色分析方法在尿液等高度复杂基质样品分析中得到了实际应用。

联用质谱仪的液相色谱具有强大的组分分离与鉴定能力，成为检测复杂有机物的有效手段，而且方法简便、准确，在最短6 min内就能完成保健食品或运动饮料中包括维生素B12在内的多种水溶性维生素的同时检测，该方法在较宽范围内线性关系良好（r≥0.997），检出限 0.10 μg/g[13-14]。

在实际医疗诊断中，同型半胱氨酸、维生素B6、B9和B12常作为一组相关指标需同时测定，Shaik等[15]开发的快速分辨液相色谱法可同时测定人血清中的这四类物质。流动相由甲醇和1-七磺酸钠盐（33∶67）与0.05%三乙胺的混合物组成，整个混合物的pH值调整为2.3，流速为0.5 mL/min，使用保持在28℃的C18柱（5 μm；150 mm×4.6 mm）在一个柱炉中分离，并在210 nm处进行检测，该方法对四类物质检测范围均为50 ng/mL～1 600 ng/mL，同型半胱氨酸、维生素 B6、B9和B12的检测限值分别为 5、5、10、10 ng/mL，方法达到了良好的精度和准确性，并符合食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的要求。

2.2 微生物检测方法

维生素B12具有多种分子构造和差异化的生物效价，微生物可有效识别，检测方法具有结果可靠，检出限低等优点。沈泓等[16]利用莱士曼氏乳酸杆菌对维生素B12极高的灵敏性和特异性，通过控制该菌的繁殖程度，采用抗生素光度测量仪实时测控培养以及智能终点判断，大大减少人工操作，提高了准确性，实现对维生素B12的定量检测。微生物培养法适用于检测食品中的微量维生素B12，在0.001 ng/mL～0.010 ng/mL浓度范围内线性关系良好[17]。

微生物培养法操作繁琐，步骤冗长等缺点限制了方法的实际应用范围，为此多家公司开发了微孔板式微生物法定量检测试剂盒，方法以Tris缓冲液稀释样品，加入冻干的莱士曼氏乳酸杆菌测试菌球，采用Costar 3599细胞培养板培养，使用酶标仪测定结果，该方法回收率为89.9%～110.2%，定量检测限为0.01 ng/g（mL）[18]。相比于传统微生物培养法，微孔板形式的微生物试剂盒法优势明显，它不仅容易操作，而且数据更精准稳定，平行性更好[19]。

2.3 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked iImmunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，是目前分析化学领域中的前沿课题之一。

李江等[20]使用60%甲醇-水对婴幼儿配方奶粉样本进行提取，通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定了样本中的维生素B12。采用的维生素B12ELISA检测试剂盒酶标板，包被有维生素B12抗原，并保持免疫活性，受检样品中的维生素B12与抗原反应后形成抗原抗体复合物，洗涤分离其他物质后，加入酶反应底物，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标品中维生素B12的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度，实际检测表明，该方法线性相关系数大于 0.996，范围在 3 μg/kg～243 μg/kg，与高效液相色谱法检测结果的相对标准偏差小于10%，方法操作简便，准确灵敏。

Kong等[21]开发了一种间接竞争性酶联免疫吸附法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，IC-ELISA）检测不同食品中维生素B12的4种主要形式氰钴胺、羟钴胺、腺苷钴胺和甲钴胺的方法，其检测极限为0.065 ng/mL。检测维生素片、能量饮料和婴儿奶粉样本中的维生素B12，采用IC-ELISA方法的回收率在81%～122%之间，因此，这种敏感且快速的方法，适合现场检测和快速筛选大量样本。

2.4 原子吸收光谱法

原子吸收光谱法是重要的维生素B12检测方法，其原理主要利用了维生素B12中独有的配位金属元素钴。Adolfo等[22]基于特定的Co谱线的相对丰度值，用高分辨率连续源原子吸收光谱法测定维生素B12样品中的钴，从而间接的测定样品中维生素B12的含量，检测限度为3.64 mg/L，用该方法检测液体生物制剂时，甚至不需要对样品做前期处理，非常方便实用。

2.5 电感耦合等离子检测法

电感应耦合等离子体（inductively coupled plasma，ICP）是原子发射光谱的新型光源，可形成10000K温度的等离子焰炬。用它做激发光源具有检出限低、线性范围广、电离和化学干扰少、准确度和精密度高等分析性能。

王国玲等[23]建立了电感耦合等离子体质谱（induc tively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS） 法间接测定B族维生素片中维生素B12含量的方法，样品经微波消解后，采用在线加入内标校正基体效应，用ICP-MS测定钴离子浓度间接测定样品中维生素B12的含量。方法在 1.0 μg/L～100.0 μg/L线性范围内具有良好的线性关系，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.17%～3.03%，方法检出限为0.014 mg/kg，适用于食品中维生素B12的测定。

联用高效液相色谱的（high performance liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）更方便了样品的前处理，适用于各类配方食品或复杂基质中维生素B12的测定。刘杰[24]将样品经0.01 mol/L盐酸液化定容后，在HLB固相萃取小柱上分别用7%和25%乙腈溶液淋洗和洗脱样品，高效液相色谱C18反相色谱柱（100 mm×2.1 mm，3μm）进行分离，甲醇-8mmol/L乙酸铵水溶液（19∶81，体积比）为流动相，等度洗脱，用ICP-MS测定钴离子浓度并间接测定样品中维生素B12的含量。试验结果表明，在7 min内可完成化合物的分析，目标化合物出峰峰型较好，维生素B12在0.1 μg/L～500 μg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.999，检出限为0.02 μg/kg，高效液相色谱的引入使（HPLC-ICP-MS）检出能力明显优于（ICP-MS）。

2.6 电化学传感器方法

在过去的几十年里，电化学传感器是研究人员最感兴趣的话题之一。他们在食品质量的确定、临床问题的控制和诊断以及代谢控制等方面被广泛应用。

Yang等[25]利用单分子修饰电极建立了半衍生伏安法检测维生素B12。维生素B12在0.01 mol/L HCl溶液中，以100 mV/s为单位，在自行组装的亚硫代乙酸修饰金电极上，通过CN-裂化完成的单电子转移，将主要的Co（iii）形式直接还原为0.21 V，而后一种物种则与basing-B12r相平衡，其在0.16 V时立即被还原为B12s。维生素B12的扩散会控制阴极的峰值电流，0.21 V的半导伏安度峰值电流与维生素B12的含量在4.0×10-9mol/L～4.0×10-5mol/L 之间呈线性关系，检测极限为1.0×10-9mol/L。该方法成功地应用于药物制剂中维生素B12含量的测定。

Nisansala等[26]创造了一种用于食品和医药产品中维生素B12检测的简单、灵敏、低成本微流体纸质电化学传感装置。分别用银导电油墨和石墨粉制作了参考电极和反电极，以200mV/s的扫描率，5 mmol/L～25 mmol/L浓度的维生素B12在+2V时的循环伏安图电流具有线性关系。

Moazeni等[27]在金电极表面组装了一维形态的D-苯丙氨酸，通过循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）、电化学阻抗谱法（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）和差分伏安图（differential pulse voltammetry，DPV）研究了改性电极的电化学性能。最后，通过测量不同浓度的维生素B12，得到此生物传感器的检测限为 1.6 μmol/L。

诊断工具中纳米材料的使用和进步，通过提高传感器的性能创造了一个极好的检测前景。Parvin等[28]在三嗪树状聚合物（ferromagnetic nanoparticles/triazine dendrimer，FMNPs@TD）的存在下，对金电极（Au）加入铁磁性纳米颗粒，通过吡咯（Py）的电聚合，构建了一种对维生素B12高灵敏度和选择性的新型电化学传感器。金/聚吡咯/铁磁性纳米颗粒/三嗪树状聚合物电极对丁烷-罗宾逊缓冲液中的维生素B12还原具有电催化活性。由此产生的传感器在具有较宽的测定线性范围（2.50 nmol/L～0.5μmol/L）和高重现性响应（RSD2.3%），该传感器应用于食品样品中维生素B12的测定时，还具有低干扰和长期稳定性。

2.7 表面离子共振方法

表面等离子共振（surfaceplasmonresonance，SPR）是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。先将一种生物分子（靶分子）键合在生物传感器表面，再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流经生物传感器表面。生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，生物分子间反应的变化即被观察到。这种方法对生物分子无任何损伤，且不需任何标记物。

孙明君等[29]利用表面等离子共振技术，建立了快速定量测定牛奶中维生素B12的方法。将钴胺素共价偶联到表面等离子共振芯片CM5表面，并对竞争结合的维生素B12结合蛋白的结合浓度进行优化，成功检测了牛奶产品中维生素B12含量。结果表明，制备的芯片稳定，50个循环相对标准偏差（RSD）小于10%，方法的检测限为0.006 μg/100 g，回收率为92.1%～104.1%。所建立的方法可以在6 h内完成样品的前处理和检测，是一种简便、快捷的定量检测方法。

2.8 荧光分子探针法

荧光分子探针检测的最大特点是设备简单、操作简便、分析速度快及灵敏度高，近年来成为化学检测领域的持续热点。

Selvakumar等[30]建立了一种基于dipstick的免疫化学发光生物传感器，该方法是一种直接竞争型格式，将维生素B12抗体固定在硝化纤维素膜上，然后用维生素b12-碱性磷酸酶结合维生素B12以便于竞争反应。用底物 2-氯-5-（4-甲氧基螺）{1，2-二氧基环-3，2 美分-（5美分-氯基）三环[3.3.1.13]decan}-4-YL）-1-苯基磷酸（cdp-star）进一步处理，生成化学发光，所产生的光子数量与维生素B12浓度成反比。经过系统优化后，检测的极限为1 ng/mL。该方法适用于能量饮料样品中维生素B12的准确、敏感和高通量筛选。

其它多种构建方式的荧光分子探针也用于维生素B12的检测，如：基于RNA核酸适配体的金纳米粒子比色传感器[31]，纳米级的氧化石墨烯[32]以及热还原碳点（t-cd）荧光共振能量转移传感器[33]等。

最新型的荧光分子探针材料是碳量子点（carbon quantum dots，CQDs），CQDs作为一种新兴的 0 维碳纳米材料，自从2006年第一次被发现以来，一直受到广泛的关注并迅速发展成为一种优良的荧光纳米材料，贺平等[34]介绍了其中红色荧光碳量子点的光谱特性。

Li等[35]以硝酸硫胺（TN）为单体材料，采用一锅水热法制备了量子产率为10.4%的氮硫共掺杂碳量子点（N，S-doped carbon quantum dots，N，S-CQDS）。随着维生素B12浓度的增加，N、S-CQD（作为供体）向维生素B12/酒石酸（作为受体）的能量转移速率和效率也会增加，并且会随着激发波长的变化而变化（从338 nm到408nm）。基于此原理设计的一种多功能荧光探针，用于维生素B12的检测限为15.6 nmol/L，回收率97.5%～104.2%。

Wang等[36]通过对聚胱氨酸二磷酸胆碱（cdpc）和乙二胺的热解，开发了一种绿色、低成本、直接的合成高荧光仿生碳量子点（bioinspired carbon quantum dots，B-CQDs）。在450 nm波长下发射强的荧光对维生素B12具有高选择性的超声波敏感能力，测定发现维生素B12的检测限值低至 81 nmol/L。同时，3-（4，5）-二甲基硫亚氮（-z-y1）-3，5-苯基四氮酰胺（mtt）、溶血测定和红细胞形态表征的结果证实了（B-CQDs）良好的低毒性和生物相容性，可以作为一种有效的荧光传感探针，用于生物样品中维生素B12的无标签敏感和选择性检测。人类宫颈癌细胞（hela）的成像试验证明，（BCQDs）已成功应用于活细胞中维生素B12的检测，并具有在人体内扩大应用的潜力。

相比于传统染料分子和半导体材料，CQDs除了具有良好的抗光闪烁性和抗光漂白性，还具有杰出的低毒性和生物相容性[37]，这使得近些年CQDs在生物成像和光学探针等领域得到了广泛研究，CQDs荧光分子探针对维生素B12检测已达到生物学意义的水平。

2.9 其他检测方法

在多学科技术进步的引领下，现代检测技术已经进入了全面开花的时代。Gustavo等[38]使用流动式膜透析分析系统，实现了牛奶中维生素B12的在线监测。首先用三氯乙酸和离心法对牛奶样品进行预处理，以消除蛋白质和脂肪，然后使用透析器结合流动连续歧管，对维生素B12进行透析，并在361 nm对其进行分光光度监测。该方法适用于不同种类的牛奶（脱脂牛奶和半脱脂牛奶、淡奶、无乳糖牛奶、液体和全粉牛奶）的快速在线检测，方法的相对标准差为0.45%，透析率为5.8%。

光在发生拉曼散射后其频率会发生变化，不同原子团振动的频率是惟一的，因此拉曼光谱被称为“指纹光谱”，可以照此原理鉴别出组成物质的分子种类，表面增强拉曼光谱（surface-enhanced raman scattering，SERS）结合了分子指纹特异性和潜在的单分子敏感性，使拉曼光谱分析技术出现了质的飞跃，Radu等[39]使用SERS技术实现了食品中维生素B2和维生素B12的同时检测。

Li等[40]使用硼酸仿射导向表面印迹制备了维生素B12的分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）。首先将维生素B12模板共价固定在硼酸功能磁性纳米粒子表面，随后通过水聚合形成聚苯胺乙醇的薄印迹涂层来覆盖基板表面，去除模板后，在印迹层中形成与模板分子大小和形状互补的三维腔体。印迹涂层亲水性强，残留硼酸有限，避免了非特异性结合。制备的MIP微粒子具有良好的特异性和较高的结合强度，成功地应用于牛奶中维生素B12的分析。

3 总结与展望

本文综述了目前人类血液、血清、尿液、体细胞、食品和药品中维生素B12的测定。其中以光谱学为重点的现行方法是主要检测方式，包括原子吸收，电感耦合等离子发射光谱，荧光分子探针为主的化学发光测量，表面等离子体共振和拉曼光谱等，以对维生素B12超高的灵敏度成为近年来的研究热点和前沿领域，适用于食品、生物以及医学监测领域。电化学传感器则以出色的自动监控功能在食品质量的确定、临床问题的控制和诊断以及代谢控制等方面被广泛应用。液相色谱为代表的色谱和质谱技术作为现代实验室的主流分析设备，以其通用性强而被检测工作者广泛接受。微生物检测法虽然程序繁琐，但作为独特的活性维生素B12生物识别方法，成为婴幼儿食品以及部分国家的法定方法组成。酶联免疫吸附测定法则是成功的快检方法，适合现场检测和大量样本快速筛选。随着维生素B12认知的不断提高，以上这些有发展前途的技术，会在增强方法灵敏度和使用途径上不断发展，以提高维生素B12检测的重现性、选择性和速度。