线粒体凋亡通路在棕榈酸诱导的血管内皮细胞凋亡中的作用

许文虎，金春子，王晓龙，陈 晨，崔 兰

(延边大学附属医院 1. 心血管内科、2. 中心实验室，吉林 延吉 133000)

动脉粥样硬化是一种以动脉血管壁内脂质斑块不断累积为特征的慢性、进展性疾病[1-2]。在动脉粥样硬化的发病及外周血管疾病、脑卒中、冠状动脉疾病等并发症产生过程中，病理性血脂因素已经成为了关键的危险因素[3-4]。血脂异常一般是指血中致动脉粥样硬化的脂质——总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油、载脂蛋白B和脂蛋白A增高，而抗动脉粥样硬化的脂质——高密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白A降低。大量循证医学资料证明，积极调脂治疗可明显减少致死性和非致死性心肌梗死发生的风险，以及冠心病的致残率和致死率，并降低对经皮冠状动脉介入治疗和冠脉旁路移植术的需求，调脂治疗已成为动脉粥样硬化预防策略中最重要的措施之一[5-6]。棕榈酸(palmitic acid，PA)又称软脂酸，是一种饱和高级脂肪酸，以甘油酯的形式普遍存在于动植物油脂中，在自然界中分布很广，通常用于建立脂毒性细胞模型和动物模型。因此，本研究以PA诱导建立人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)脂毒性损伤模型，分析其机制与线粒体凋亡通路的相关性，为内皮细胞脂毒性损伤研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 HUVECs购自上海基免实业有限公司。

1.1.2试剂 凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)、细胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax抗体，均购自美国Abcam公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自罗氏公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒、MTT检测试剂盒，均购自碧云天公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶，均购自美国Gibco公司； PA、线粒体通透性抑制剂环孢素A (ciclosporine A，CsA)，均购自Sigma公司。

1.1.3仪器 电泳槽、电转膜仪(Bio-Rad公司)；高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；多功能酶标仪(上海沛欧分析仪器有限公司)；荧光显微镜、倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；二氧化碳培养箱(上海皓庄仪器有限公司)；紫外分光光度计(上海奥析科学仪器)；化学发光凝胶成像系统(美国ProteinSimple公司)。

1.2方法

1.2.1PA的配制 水浴锅温度保持至37 ℃，称取PA溶于无水乙醇中，使母液浓度达到100 mmol·L-1，-20 ℃长期保存，避免反复冻融,可少量多管分装。或在37 ℃水浴条件下，将其溶于0.5% BSA的高糖DMEM(含血清、双抗)，涡旋混匀，滤膜过滤后使用，4 ℃冰箱保存。

1.2.2细胞培养 从液氮中取出细胞，接种于DMEM高糖培养基(含25 mmol·L-1的葡萄糖、10%胎牛血清、100×青霉素-链霉素溶液)中，在37 ℃、5% CO2培养箱培养24～48 h后，更换培养液，直至细胞生长密度达到70%～80%时，用0.25% 含EDTA的胰酶轻轻吹打消化、传代至所需培养皿中，进行实验研究。

1.2.3实验分组 实验分组分三类：浓度梯度测试PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)；时间梯度测试(0、12、24、48 h)；抑制剂实验分为对照组，0.4 mmol·L-1PA组，以及10 μmol·L-1CsA预处理2 h后，再给予0.4 mmol·L-1PA组。

1.3检测指标

1.3.1MTT检测细胞增殖率 以每孔含1×106个细胞为标准，接种于96孔板中(设立6个复孔)，置CO2培养箱孵育，待细胞贴壁牢固，换为含PA的培养基，继续培养至所设定时间，然后吸弃上清液，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，将96孔板放置CO2培养箱培养4 h后，弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶标仪测各孔OD值。细胞活力=OD处理孔/OD阴性对照孔×100%。

1.3.2ROS含量的检测 HUVECs接种6孔细胞培养板，当细胞贴壁生长至70%～80%融合度，按组别给药后，培养箱内孵育24 h，PBS反复冲洗后，细胞培养板内加入10 mmol·L-1DCFH-DA，培养箱内孵育30 min，PBS反复冲洗后，采用荧光显微镜进行拍照，并用ImageJ 1.41软件分析绿色荧光强度。

1.3.3Western blot法检测线粒体凋亡通路蛋白表达水平 把分组好的实验细胞放5% CO2培养箱培养，24 h后，PBS洗去细胞杂质，每皿加入裂解液充分裂解细胞，细胞刮刀收集于离心管，离心后收集上清，用BCA试剂盒测定蛋白含量。根据所测浓度，等体积上样于5%～15%的SDS-PAGE凝胶，电泳进行分离，冰浴下湿法转移至PVDF膜2 h，用5%的脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，加入对应一抗4 ℃摇床孵育过夜。次日换为HRP标记的二抗，室温孵育1 h，用ECL化学发光显影，然后凝胶成像系统检测AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin的表达水平。

1.3.4TUNEL检测细胞凋亡 培养皿细胞长满到90%，胰酶消化细胞，收集于15 mL离心管，离心5 min，加入培养基使细胞被吹打成细胞悬液，每孔500 μL，接种于铺有爬片的24孔板内，放CO2培养箱培养。贴壁细胞融合度达到70%～80%时，给予PA，继续孵育24 h，PBS反复冲洗后，4%多聚甲醛固定，采用TUNEL凋亡试剂盒染色，荧光显微镜下实时观察，进行拍照。

2 结果

2.1PA对HUVECs细胞增殖的影响体外培养细胞，用含PA (0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培养基刺激24 h。如Fig 1A所示，随着PA浓度的增加，HUVECs增殖率呈下降趋势，PA浓度在0.4 mmol·L-1时开始明显降低(P<0.01)；Fig 1B结果显示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培养基刺激细胞0、12、24、48 h后，随着刺激时间的延长，细胞数量明显减少，刺激细胞24 h后的数据差异均具有统计学意义(P<0.01)，其中在刺激细胞24 h时，开始明显降低(P<0.01)。因此，我们将PA浓度定为0.4 mmol·L-1，刺激时间定为24 h开展后续实验。

Fig 1 Influence of PA on cell viability in HUVECs n=5)

A: Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1.**P<0.01vs0 mmol·L-1group; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1PA for different time, and inhibition of cell viability was calculated from MTT assay.##P<0.01vs0 h group

2.2PA刺激对HUVECs细胞内ROS水平的影响如Fig 2所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激时间在24～48 h时，细胞内ROS的水平出现高表达状态，而24 h PA刺激组与48 h PA刺激组之间的ROS水平差异无显著性(P>0.05)。

Fig 2 Effects of PA on ROS of HUVECs (scale bar: 50 μm)

The intracellular level of ROS in HUVECs was estimated by DCFH-DA, a fluorescent probe. DHE is green fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with DHE after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

2.3PA对HUVECs细胞线粒体凋亡通路蛋白表达的影响如Fig 3所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培养基刺激细胞24 h，与正常对照组相比，Bcl-2表达水平明显下降(P<0.05)，而AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax等线粒体凋亡通路蛋白表达在高脂刺激24 h后均出现高表达，高于正常对照组(P<0.05)；而24、48 h PA刺激组之间的线粒体凋亡通路蛋白表达差异均无显著性(P>0.05)。

2.4PA对HUVECs细胞凋亡的影响如Fig 4所示，在显微镜下观察到细胞的红色荧光强度与给药时间呈正比，随着给药时间的延长，红色荧光增强，提示细胞凋亡增加。PA刺激24 h时，细胞呈现明显的固缩现象，表现出明显的凋亡相关形态学改变，其中PA刺激24 h与48 h相比，荧光强度差异无显著性。

2.5线粒体凋亡通路与PA所致HUVECs细胞损伤的相关性如Fig 5所示，在显微镜下观察到0.4 mmol· L-1PA刺激24 h时细胞的红色荧光明显增强，提示细胞凋亡明显增加。给予线粒体通透性抑制剂CsA预处理，细胞的红色荧光明显变弱，其荧光强度与对照组细胞几乎相同，可见CsA有效阻断了PA所致的细胞凋亡。

Fig 3 Influence of PA(0.4 mmol·L-1)on expression of mitochondrial apoptosis pathway protein in HUVECs n=3)

*P<0.05vs0 h group

Fig 4 Effects of PA(0.4 mmol·L-1) on apoptosis of HUVECs (scale bar: 50 μm)

TUNEL is red fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with TUNEL after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

Fig 5 Influence of mitochondrial apoptosis pathway inhibitor CsA on apoptosis of HUVECs exposed to PA (scale bar: 50 μm)

Fluorescence images of HUVECs stained with TUNEL after cells were incubated for 24 h with control (A), 0.4 mmol·L-1PA (B) and 0.4 mmol·L-1PA+10 μmol·L-1CsA (C).

3 讨论

动脉粥样硬化的发生、发展机制错综复杂，其原因可以归因于部分环境因素和部分先天性因素。这些环境因素和先天性因素虽然不能被认定为动脉粥样硬化的绝对病因，但在某种程度上可以归结为诱发动脉粥样硬化的高风险因素，其防治在临床也越来越得到重视。不少文献曾对此类高风险因素进行过研究，其中高血脂被报道为动脉粥样硬化的关键危险因素之一，受到广泛关注，除此之外，还有糖尿病、吸烟、高血压等[7-8]。近年来，动脉粥样硬化发病机制的相关研究取得了一些成果，阐明了脂毒性内皮损伤导致动脉粥样硬化的部分机制，但其机制错综复杂，尚不清楚其具体的深入机制。基于此，本研究拟通过PA所致血管内皮细胞损伤模型，探讨高脂所致血管内皮细胞损伤的机制。本研究中，当PA刺激HUVECs，细胞存活率明显降低，证实了脂毒性损伤对内皮细胞增殖功能的影响，符合文献报道。

内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化的起始阶段[9-11]，研究表明，ROS和钙离子是诱导凋亡的两个重要因素[12-13]。ROS的产生及脂质过氧化导致钙离子从线粒体释放，过多的细胞内钙离子也会导致ROS形成增加，也引起了线粒体膜电位崩溃、ATP衰竭，从而促进凋亡。研究表明，脂毒性刺激可以抑制血管内皮细胞Bcl-2蛋白的表达[14]。而Bcl-2大多定位于线粒体外膜上，调节线粒体外膜通透性，具有抑制凋亡的作用[15]。Bax是与Bcl-2共沉淀的一种蛋白质，促进细胞凋亡[15]。高脂刺激时，细胞内会产生大量的ROS，而ROS的产生会影响Bcl-2和Bax的表达，进而影响线粒体通透性，外膜孔径变大，变大的线粒体孔径导致线粒体中Cyt-C的释放以及AIF的大量表达，进而促进线粒体释放更多的Cyt-C，而被激活的caspase又促进AIF的释放，继而引起caspase级联反应中具有代表意义的cleaved caspase-3蛋白的表达，从而激活后续的细胞凋亡信号。可见，ROS诱导的线粒体凋亡机制可能参与了脂毒性内皮细胞凋亡的发病机制。本研究提示，PA刺激24 h时，HUVECs内ROS水平明显升高，此现象说明血管内皮细胞可在高脂的刺激下出现明显的氧化应激损伤。另一组实验说明，PA刺激HUVECs 24 h后，线粒体促凋亡通路蛋白AIF、Cyt-C、cleaved caspase-3、Bax的表达明显升高，线粒体抗凋亡通路蛋白Bcl-2的表达明显降低，Bax/Bcl-2的比值明显升高，以上结果提示氧化应激有可能通过激活线粒体凋亡通路，从而引起心肌细胞的损伤。本研究中，当用线粒体通透性抑制剂CsA预处理时，PA所致的HUVECs凋亡明显减少，提示阻断线粒体凋亡通路可以明显减轻高脂刺激对血管内皮细胞的损伤，也进一步证实了脂毒性血管内皮细胞的损伤与线粒体凋亡通路的相关性。

综上所述，PA对血管内皮细胞的脂毒性损伤，可通过氧化应激-线粒体凋亡通路的激活，使细胞出现明显的凋亡现象，当阻断线粒体凋亡通路时，血管内皮细胞的脂毒性凋亡被明显缓解。总之，线粒体凋亡通路的调控对高脂所致的血管内皮细胞损伤的防治有指导意义。

(致谢: 本文实验主要在延边大学基础学院药学分析实验室、基础学院药理学实验室、附属医院中心实验室完成，由湖北科技学院医药研究院省重点实验室协助完成。感谢廉丽花副教授、李晶副教授、硕士生马伟平、金艳红、权丽娜等对本实验的帮助与指导。)