三白草AP1基因的表达和进化选择压力分析

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(云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201)

AP1(APETALA1)基因属于MADS-box家族基因，它即可以对花分生组织进行调控，又可以对花器官形态基因进行调控[1]。通过转基因表现出提前开花的形象[2-4]。由此说明，AP1基因具有促进植物开花的作用，且AP1基因在不同植物间具有保守性。

随着越来越多的动植物基因组数据的积累，生物信息学方法已经成为研究基因家族序列特征和进化关系的工具。当选择系数ω为非同义/同义突变率比值，即dN/dS，其可以反映生物体的进化趋势，当ω>1，ω=1和ω<1分别代表在进化过程中基因承受正向选择、中性选择和纯化选择[5]。本实验根据已克隆出的被子植物较原始类群三白草(Saururus chinensis)基因AP1，采用实时荧光定量PCR，分析AP1基因在三白草不同组织中的表达，并使用生物信息学方法构建AP1基因的系统发育树，并对AP1基因做生物进化选择压力分析，以期发现较原始类群植物三白草与其它植物间的亲缘关系及其在植物进化中承受的选择压力。

1 材料与方法

1.1 目的基因的获取

1.1.1 三白草总RNA的提取及纯化

使用Trizol法分别提取三白草幼叶、不同发育时期中，包括变白过程(半绿、半白)叶和褪白过程(半绿、半白)叶，完全变白叶、完全褪白叶和花中总的RNA。并纯化去除DNA和其余杂质。采用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。

1.1.2 PCR获取目的基因

将上步所得RNA反转录合成cDNA。根据已克隆的AP1基因设计PCR引物(表1)。PCR反应体系和反应程序按试剂使用说明操作。

表1 PCR引物

1.2 AP1基因克隆与CDS序列的筛选

用Race技术从三白草中克隆获得AP1基因，包括AP1a和AP1b2个同源序列。从NCBI下载的29个不同物种的AP1基因。以ATG为起始密码子，以TAA、TAG或TGA为终止密码子从NCBI上筛选(如表2)。

1.3 系统进化分析

根据已下载的各不同物种的AP1基因的CDS序列，进行多序列比对并构建系统发育树，用于研究它们之间的差异和各物种之间的进化关系。使用MEGA 7.0软件[7]进行分析，AP1基因序列的多重比对使用Clustal X软件完成，参数使用默认值。然后采用邻接(neighbor-joining)法构建系统发育树[8]，自举值为1 000，验证进化树的可信程度。

1.4 AP1基因编码蛋白的进化选择压力分析

使用PAML 4.9软件中codeml.exe程序对AP1蛋白所经历的选择压力进行分析。基于本研究自建进化树及CDS序列多重比对结果，对31个CDS序列编码蛋白进行选择压力分析，位点模型为M 0、M 1、M 2、M 3、M 7和M 8。利用似然比检验统计来评估成对模型：M 0 VS M 3，M 1 VS M 2和M 7 VS M 8，检测是否存在正选择位点，其结果遵从x2分布，自由度为2个模型的参数之差。

表2 AP1基因序列登录号

2 结果与分析

2.1 获取目的基因

使用PCR克隆得到三白草AP1a和AP1b2个同源基因，由于在实验过程中严格控制了模板的使用量，因此，电泳检测结果能一定程度反映不同组织中目的基因的相对表达量。AP1a和AP1b2个同源基因，在花中的表达均高于在叶中，然后在变白和退白 的白叶部分表达量比较高，AP1b基因在三白草各个组织中的表达结果如图1。

2.2 AP1基因CDS序列的同源性分析

使用ClustalX 2.1软件对三白草AP1a、AP1b和选用的29个物种的AP1基因的CDS序列做多重序列比对(如图2)，并使用MEGA 7.0软件构建系统发育树，系统发育树输出为tree文件。

注：1为幼叶；2为变白过程的一半绿叶；3为变白过程的一半白叶；4为完全变白叶；5为褪白过程的一半白叶；6为褪白过程的一半绿叶；7为完全褪白叶；8为花。图1 AP1b基因在不同组织中的克隆

从序列比对结果可以看出，鱼腥草(AB 089153.1)与三白草AP1a的同源性最高；AP1a和AP1b的同源性很高，但也存在一些差异；小百合(AB 618669.1)、水稻(AB 041020.1)、文心兰(KC 426946.1)与三白草的2个AP1同源基因的同源性也很高，其余植物根据不同科属与三白草的2个AP1同源基因的同源性较高，但差异逐渐增加。

2.3 AP1基因编码氨基酸序列的同源性及结构域分析

使用ClustalX 2.1软件对三白草AP1a、AP1b和其它物种比对结果，如图3。结果显示，AP1氨基酸序列的5'端保守性较高，3'端保守性较低，在3'端存在单子叶植物AP1/SQUA基因所特有的paleoAP1(LPPWML)结构域。

图3 AP1蛋白结构域

2.4 AP1基因编码蛋白的进化选择压力分析

通过不同的模型对AP1 2个同源基因编码蛋白AP1a和AP1b进行了分析。通过codeml程序的算法对AP1a和AP1b编码蛋白进行分析得到不同模型M 0、M 1、M 2、M 3、M 7、M 8的相关参数(表3)。与模型M 1、M 0、M 7相对应的M 2、M 3及M 8的假定条件均允许ω值大于1，即M 2、M 3及M 8的假定中均有正选择位点，通过相对应的2个模型进行LRT(likelihoodratiotest)[9]统计来确定模型是否显著。从表4可以看出，AP1蛋白的M 0模型预测的ω值远小于1，但是在LRT检验中M 3模型优于M 0模型，而M 2模型并不优于M 1模型，M 8模型也并不优于M 7模型。6个模型的结果均显示ω<1，说明AP1在进化过程中承受负选择，AP1基因松弛产生功能不同的拷贝。而在几个模型中并未检测到阳性选择位点。

表3 AP1蛋白适应性进化分析

3 讨 论

AP1基因已经在多种植物中得到克隆且AP1基因在植物中具有很高的保守性。本研究在已克隆三白草AP1基因的2个同源基因的基础上，比较不同物种中AP1基因的表达和在进化过程中承受的进化选择压力。结果显示，AP1a基因和AP1b基因在花中的表达明显高于叶中，这与前人研究吻合。AP1基因的多重序列比对结果显示，三白草AP1同源基因AP1a基因的核酸序列与鱼腥草相比有最高的同源性，而AP1b基因与鱼腥草和AP1a基因虽然同源性很高，但也存在较多的序列差异，AP1a基因和AP1b基因的核酸序列与小百合，水稻和文心兰也有较高的同源性。这说明AP1基因在不同植物间有所保守，但在同一个物种中AP1基因又存在着分化。

三白草AP1a、AP1b和其它物种的AP1编码氨基酸序列多重序列比对结果显示，AP1 3′端具有单子叶植物AP1/SQUA基因所特有的paleoAP 1(LPPWML)结构域。

表4 AP1蛋白阳性选择位点

通过对31个AP1基因编码蛋白的进化选择压力分析，反映出AP1基因在系统发育的过程中主要经历了纯化选择。但未在研究中检测到阳性选择位点，推测AP1基因在进化过程中有较高的保守性。在系统发育树中也验证了这一点。但实际上在长期的进化过程中氨基酸序列会发生大量的非同义突变，这些突变大部分是有害的，而当AP1基因出现基因松弛时，就可以出现多个拷贝，出现的不同结构有：a基因功能丧失；b基因亚功能化；c基因新功能。本研究使用的三白草2个AP1的同源基因，也说明AP1基因在三白草中有松弛现象，从多重序列比对结果可以看出，AP1a基因和AP1b基因同源但又有较大的差异，猜测有可能是出现了基因的新功能化。但AP1基因在三白草中出现了哪些新功能还有待进一步的验证。