NaCl盐胁迫对洋葱鳞片叶内表皮细胞凋亡的影响

王鹏洋，付泽元，孙立坤，乔硕

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040）

细胞凋亡即细胞程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD），是细胞生物体中一些细胞采用的由自身基因调控通过信号传导的细胞主动死亡的方式[1]。它涉及一系列基因的激活、表达及调控等作用，不造成炎症和自体的损伤，是细胞为了更好地适应自下而上环境而主动争取的死亡过程[2]。细胞凋亡是细胞重要的生命活动特征，在生物体的进化、内环境的稳定及多个系统的发育中起着重要作用[3-4]。对细胞凋亡的研究最早始于动物细胞，植物细胞凋亡研究起步较晚。植物细胞凋亡存在于植物体正常生长发育的各个阶段，是植物体抵御病原体和抵抗逆境的重要手段[4-6]。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为新鲜的洋葱，取其鳞片叶内表皮，现用现取，保持新鲜湿润。

1.2 方法

1.2.1实验设计

设计处理材料的NaCl浓度梯度和时间梯度：浓度设为5个梯度：0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L；时间设为 3 个梯度：0.5h、1h、2h。

1.2.2材料处理

将配置好的不同浓度的NaCl溶液分装到2ml离心管中，每小管中装1ml，每浓度梯度5管备用；连洋葱肉带内表皮切洋葱小块，面积约0.5cm×0.5cm，将洋葱小块泡入离心管溶液中。后开始计时，分别在0.5h、1h、2h时从每个浓度梯度的离心管中取出一块洋葱块，撕下洋葱鳞片叶内表皮置于载玻片上。设置对照组，即直接固定染色制片的一组。

1.2.3装片制作与观察

卡诺固定液固定15分钟，95%酒精处理5分钟，70%酒精处理5分钟，清水将酒精洗去，3%甲基绿∶派洛宁=3∶1，染色30分钟，用清水洗去染料浮色，用分析纯丙酮漂洗5秒，再用清水洗去丙酮，盖上盖玻片后用吸水纸洗去多余水分，后用光学显微镜镜检观察。观察细胞凋亡情况与形态特征变化，对观察结果进行拍照，并计算细胞凋亡率。

细胞凋亡率=细胞凋亡数/视野中细胞总数×100%[7]。

1.2.4数据分析

用MicrosoftExcel和Origin软件对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 对照组细胞形态结构观察结果

空白对照组在NaCl处理Oh的细胞形态结果如图1所示，细胞整体形态饱满且轮廓分明；细胞膜完整，紧贴细胞壁；细胞核呈完整的圆球形状，染色均匀，视野中没有已经凋亡的细胞。

2.2 不同浓度NaCl处理0.5h后，细胞形态结构观察结果

从图2中可见，在不同浓度的NaCl处理0.5h后，洋葱内表皮细胞发生不同程度的质壁分离，细胞壁依然完整，可以看到清晰的细胞壁轮廓；随着浓度的升高，质壁分离越明显，细胞膜皱缩程度越高，直到浓度较高的实验组有细胞膜破裂的现象出现，有的细胞正处于凋亡的过程中，可见凋亡小体；细胞核在浓度高的实验组中不完整，染色质边缘化贴近细胞膜。

图1对照组细胞形态结构图

2.3 不同浓度NaCl处理1h后细胞形态结构观察结果

从图3中可见，在不同浓度的NaCl处理1h后，细胞质壁分离程度较0.5h实验组的相比其程度不再加大；NaCl浓度为0.1mol/L和0.2mol/L的实验组与处理0.5h相比总体变化不大，细胞膜没有破碎痕迹，没有出现凋亡小体，细胞核清晰球状没有大的变化；0.5mol/L实验组处理1h的比0.5h的细胞膜破裂的细胞数量增多，存在凋亡小体的细胞数目也增多；1mol/L和2mol/L实验组中细胞膜破碎程度加大，更多的细胞核边缘界限模糊不清晰且不完整。

2.4 不同浓度NaCl处理2h后细胞形态结构观察结果

从图4可见，处理2h后，总体染色加深，细胞质呈明显红色，细胞核绿色加深；0.1mol/L和0.2mol/L的实验组依然没有出现细胞凋亡现象，但是发现细胞核染色加深；0.5mol/L实验组中发现质壁分离现象较先前实验较明显，可见一些细胞正处于凋亡中，存在凋亡小体；1mol/L和2mol/L的实验组中，细胞进一步凋亡，细胞背景较之前不干净，有些细胞已经凋亡完成或接近凋亡完成的状态，导致细胞质膜极度残缺。

2.5 不同浓度与处理不同时间的细胞凋亡率统计分析

从图5中可见，随着NaCl浓度的升高，细胞凋亡率呈上升趋势，且趋势大致相同，浓度在0.1mol/L和0.2mol/L实验组中细胞凋亡率较低，该浓度还不至于引起细胞凋亡，浓度在0.2mol/L和1mol/L之间变化时，其凋亡率增加最快，随后凋亡率增加趋势再趋于平缓；纵向观察，随着诱导时间的增加，凋亡率有明显的增加，在浓度为2mol/L处理时间2h的实验组中，凋亡率已经趋近于100%。

3 讨论

图2不同浓度NaCl处理0.5h后细胞形态结构图

图3不同浓度NaCl处理1h后细胞形态结构图

图4不同浓度NaCl处理2h后细胞形态结构图

图5细胞凋亡率统计图

显微观察结果表明，NaCl可以诱导洋葱鳞片叶内表皮细胞凋亡，细胞凋亡的形态变化是相似的，过程是多阶段的。主要包括：细胞核浓缩、边缘化、质膜卷曲、质壁分离、细胞核消失，直至细胞膜反折，最终形成凋亡小体[8]。得到结论：NaCl浓度越高其诱导细胞凋亡的能力越强；诱导时间越长，其细胞凋亡率越高。在动物细胞中很容易观察到凋亡小体，而植物细胞中很难观察到[9]。有研究表明，细胞凋亡与caspase（胱冬酶）有关，其为信号诱导，激活caspase，后产生级联放大效应，最后导致细胞凋亡[10]。实验结果得到，浓度在0.2mol/L和1mol/L之间的凋亡率激增，预测在这个浓度范围内可以观察到更多正处于凋亡过程的细胞，下一步实验要在浓度0.2mol/L和1mol/L之间分设梯度，从而更清楚地观察洋葱细胞正处于凋亡过程中的形态结构变化。