CLU基因多态性与新疆哈萨克族及汉族阿尔茨海默病的相关性研究

张玉洁， 陆 洁， 孟新玲， 许奔奔， 徐 梦， 张 燕

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以进行性记忆及认知障碍为主要表现的中枢神经系统退行性疾病，占所有痴呆患者的60%～80%[1，2]。众所周知，遗传因素及环境因素均参与了AD的发病，不同种族及不同地区人群AD的发生率不同，本课题组前期对新疆阿勒泰地区流行病学调查，调研发现该地区55岁以上哈萨克族居民AD患病率明显高于当地汉族AD患病率，且高于全国水平，其患病率随着年龄急剧增长，尤其是80岁以上人群AD患病率高达30.28%[3]。

近年全基因组关联研究(Genome wide association studies，GWAS)发现了很多新的晚发型AD(1ateonset Alzheimefs disease，LOAD)可能的风险基因，亦发现聚集素(clusterin，CLU)中CLU基因的多态性与AD风险相关[4，5]。CLU作为细胞外伴侣，与Aβ1-40寡聚体相互作用，并能够通过封存影响其聚集和分解，研究CLU基因多态性，可能掌握重要的线索来阐明与AD发病的有关的机制。不同种族进行了多项验证研究，目前其研究结果并不一致。新疆哈萨克族是游牧民族，有自身特殊的地域环境因素、生活方式和民族习俗，遗传背景有差异性。目前有关新疆哈萨克族AD基因方面研究较少，本研究采用病例对照方法探讨CLU基因rs11136000 位点及rs9331888位点多态性与新疆哈萨克族SAD的相关性。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 收集来自全疆各地2016年1月～2018年2月在新疆医科大学附属中医医院神经退行性疾病临床大数据库的AD患者共118例，均为散发性；其中哈萨克族58例，汉族60例，男性75例，女性43例，年龄在49～91岁之间，平均(74.6±7.85)岁，选择与病例组相匹配的年龄、性别、地域环境因素、生活方式和民族习俗，并无血缘关系的非AD患者或健康志愿者作为对照组，共139例，其中哈萨克族79例，汉族60例，男性75例，女性64例，年龄在58～81岁之间，平均(72.7±6.21)岁。所有被研究对象均需在知情同意书上签字。按照新疆医科大学附属中医医院伦理委员会制定的伦理学的标准进行审核。

纳入标准：(1)患者均主要表现记忆力障碍，症状持续时间≥6 m，痴呆诊断标准采用美国精神病学会制定的DSM-IV。经全套神经精神量表进行痴呆筛查，且符合2011年美国国家衰老研究所和阿尔茨海默病学会(NIA-AA)标准制定的“很可能AD痴呆”的核心临床诊断标准。(2)改良HACHINSDI缺血评分(Hachinski ikschemic sacle，HIS)<4分，MRI排除血管性痴呆(VD)和其他可导致痴呆的神经系统疾病。(3)汉密尔顿抑郁量表(HAMD)24项版评分<17分，排除抑郁症。排除标准：由创伤、中毒、肿瘤、甲状腺功能减退症、维生素缺乏症、帕金森病、血管性痴呆及其他脑器质性疾病引起的各种痴呆。所有患者的确诊由两名神经内科副主任医师独立完成，所有的研究对象在纳入前均签署知情同意书，本研究通过新疆自治区中医医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 收集空腹静脉血5 ml并置于-80 ℃冰箱中，分批进行DNA的提取。

1.2.2 KASP技术及DNA测序检测CLU基因位点多态性 研究中的SNP基因座信息来自公共数据库NCBI GeneBank数据库，查询基因CLU标准序列(httP// www. ncbi. nlm. nih. Gov/ Gene bank/GenebankOveriew. hlm)。其序列号为rs11136000 及rs9331888位点。采用Primer Premier 3.o软件设计SNPrs11136000 及rs9331888位点的KASP引物httP：//bioinfo. ut. ee/Primer3-0.4.0/httP：//bioinfo. ut. ee/Primer3-0.4.0/)，rs11136000位点Primer_Allele FAM引物序列为5’-CTCAAACTCCTGACCCCAAG-3’，Primer_Allele HEX引物序列为5’-CTATTGCAACCATGCCTCCT-3’。rs9331888位点Primer_Allele HEX引物序列为5’-ATGCAACAGCCTCAGCTTCT-3’，Primer_Allele HEX引物序列为5’-AGGCTTCCCAGAGAAAGTCC-3’。PCR产物用LGC公司的KASP Master Mix V3.0进行反应，PCR反应程序结束后将样本置于ABI Q6中检测FAM及HEX荧光信号，收集荧光信号，仪器根据每个样本检测的荧光信号值自动分型Homozygous为纯合子，Heterozygous为杂合子。随机挑选样本进行直接测序验证KASP分型结果，将大小正确的PCR产物切胶回收后送新疆昆泰瑞生物技术有限公司测序。

1.3 统计学分析 采用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验，采用基因计数法描述SAD及对照组基因频率和基因型分布；其计数资料以例数和率(%)表示，SAD及对照组之间比较采用χ2检验和Firsher精确概率法，计算优势比(OR)及其95%置信区间(CI)表示相对风险；数据使用SPSS 22.0进行处理。借助HaPloview 4.2软件进行连锁不平衡(1inkage disequilibrium，LD)分析和单体型(haPlotyPe)分析。所有统计学检验均为双侧概率检验，检验水准以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 本研究对AD组和对照组的性别、年龄、吸烟史等相关影响因素等进行比较，结果显示两组一般资料之间均无明显差异(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

2.2 Hardy-weinberg平衡定律吻合度检验 汉族及哈萨克族病例组与及对照组CLU基因rs11136000、rs9331888基因型分布均符合Hard-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，吻合度良好。

2.3 基因多态位点检测结果 电泳图、测序图、KASP分型图结果：CLU基因rs11136000、rs9331888位点，为检测基因浓度及纯度，电泳结果见图1、3，经测序峰图分析见图2、4，KASP分型(见图5、图6)。

2.4 汉、哈SAD组及对照组CLU基因rs11136000 位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系

2.4.1 新疆SAD组及对照组CLU基因rs11136000 位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系 整体SAD组CLU基因rs11136000 多态位点T等位基因频率明显低于对照组(15.7% VS 25.2%，χ2=6.991，P=0.008)，携带T等位基因患AD风险比携带G等位基因者低44.8%(OR=0.552，95%CI=0.355～0.762，P=0.008)，SAD组TT基因型频率也明显低于对照组(1.7% VS 7.9%，χ2=7.991，P=0.018)，SAD组携带TT基因型频率患AD风险比携带GG基因型者低82.5%(OR=0.175，95%CI=0.349～0.961，P=0.034)，TG基因型患AD风险比携带GG基因型者低33.7%(OR=0.663，95%CI=0.190～0.899，P=0.024)，Logistic校正年龄、性别的影响后，发现携带T等位基因者(TT+TG基因型)患AD风险比携带GG基因型者低42.8%(OR=0.572，95%CI=0.349～0.961，P=0.034)(见表2)。

2.4.2 哈族SAD组及对照组CLU基因rs11136000 位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系 新疆哈族SAD组CLU基因rs11136000 多态位点T等位基因频率明显低于对照组(12.9% VS 27.8%，χ2=8.809，P=0.003)，SAD组TT基因型频率也明显低于对照组(1.7% VS 8.9%，χ2=8.242，P=0.016)，Logistic校正年龄、性别的影响后，发现携带T等位基因者(TT+TG基因型)患AD风险比携带GG基因型者低63.9%(OR=0.361，95%CI=0.171～0.762，P=0.007)，TG基因型患AD风险比携带GG基因型者低58.6%(OR=0.414，95%CI=0.190～0.899，P=0.024)(见表3)。

2.4.3 汉族SAD组及对照组CLU基因rs11136000 位点等位基因和基因型频率分布与AD

的关系 SAD与对照组CLU rs11136000 位点等位基因(T、G)及基因型(TT、TG、GG)频率(T：18.3% vs 21.7%，G：81.7% vs 78.3%，TT：1.7% vs 6.7% TG：33.3% vs 30.0%，GG：65.0% vs 63.3%)比较，均差异无统计学意义(χ2=0.417，P=0.51，χ2=1.782，P=0.516)(见表4)。

2.4.4 汉族SAD组及对照组CLU基因rs11136000 位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系 SAD与对照组CLU rs11136000 位点等位基因(T、G)及基因型(TT、TG、GG)频率(T：18.3% vs 12.9%，G：81.7% vs 87.1%，TT：1.7% vs 1.7%，GG：65.0% vs 75.9%，TG：33.3% vs 22.4%)比较，均差异无统计学意义(χ2=1.302，P=0.254；χ2=1.753，P=0.416)(见表5)。

2.5 CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系

2.5.1 新疆SAD组及对照组CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系 SAD与对照组CLU rs9331888 位点等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)频率比较，均差异无统计学意义(χ2=1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(见表6)。

2.5.2 新疆哈族CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系 SAD与对照组CLU rs9331888 位点等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)频率比较，均差异无统计学意义(χ2=1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(见表7)。

2.5.3 新疆汉族CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布与AD的关系 SAD与对照组CLU rs9331888 位点等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)频率比较，均差异无统计学意义(χ2 =1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(见表8)。

2.6 rs11136000及rs9331888位点单体型分析检测及与AD 危险度的关联分析 运用HaPloview4.2软件进行单体型分析，显示rs11136000及rs9331888位点进行连锁不平衡及单体型分析，结果显示rs11136000及rs9331888位点存在连锁平衡(D’=0.764)，研究对象中单体型分析显示有C-C、C-G、T-G3种单体型，果显示3种单体型频率在人群中分布差异无统计学意义。LD图(见图7)。单倍型分布(见表9)。

表1 AD组与对照组一般临床资料比较

表2 CLU基因rs11136000位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表3 哈族CLU基因rs11136000位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表4 汉族CLU基因rs11136000位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表5 汉族与哈族AD CLU基因rs11136000位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表6 整体CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表7 哈族CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表8 汉族 CLU基因rs9331888位点等位基因和基因型频率分布例数(%)

表9 CLU基因在正常组与AD组之间单倍型分布频率

图1 rs11136000位点电泳结果

图2 rs11136000位点测序结果

图3 rs931888位点电泳结果

图4 rs931888位点测序结果

图5 rs11136000KASP分型图片

图6 rs9331888KASP分型图片

图7 GLU基因rs11136000及rs9331888位点SNPs连锁关系LD图

3 讨 论

CLU基因在笫八号染色体上，也被称作载脂蛋白J(APoJ)基因，编码凝聚素，位于染色体8P21-P12上，与APOE有一定相关性，是分布在外周循环系统和大脑中的一种多功能脂蛋白，参与脂质运输，同时也参与Aβ的清除、细胞凋亡、膜循环、炎症反应[6]。研究表明，CLU多态性可以通过改变Aβ积聚来调节AD易感性，且CLU变体可能通过其对Aβ沉积发挥作用和影响海马萎缩[7]。研究表明载脂蛋白J血浆浓度与AD患者严重程度和疾病进展速度以及内嗅皮质和海马萎缩有关[8，9]。AD的前驱期，MCI患者血浆载脂蛋白J水平升高也与较低的脑萎缩发生率有关，这种萎缩涉及海马和内嗅皮质，即在早期阶段影响大脑区域AD发病机制，结果表明聚集蛋白水平在AD前驱阶段已开始以选择性的方式沿AD发生级联反应。这种保护性血浆反应可能至少部分地调节MCI向AD痴呆的进展[7]。2009年两个大型GWAS首次报道CLU与LOAD显著有关[4，5]，由此推测CLU基因与AD发病密切相关，可能掌握重要的线索来阐明与AD发病有关的机制。

我们首次分析了新疆哈萨克族人群CLU基因rs11136000 位点与AD的相关性。结果显示CLU基因rs11136000 位点与AD风险相关，TT基因型和T等位基因(OR=0.361，95%CI=0.171～0.762，P=0.007)可能降低新疆哈萨克族人群AD的发病风险。有研究表明rs11136000等位基因T可延缓在MCI到AD进程[7]，有趣的是其他研究表明，与非携带rs11136000的G等位基因相比，在携带rs11136000的G等位基因的认知正常的个体中更容易发展成MCI或AD，且在记忆固有区域大脑局部脑血流量明显增加[10]。在一项针对哥伦比亚人群研究[11]发现CLU基因rs11136000位点最小等位基因T能降低AD风险(OR= 0.66，P= 0.028)，其结果受年龄、血统、APoEε4状态的影响。我们研究结果同SeshadriS等[12]在欧洲人群研究一致。然而一项关于巴西人群[13](70%高加索人及30%非高加索人)及印度人群[14]的研究未发现CLU基因rs11136000位点多态性与AD相关。Wang等[15]研究显示中国汉族CLU rs11136000多态性与AD风险相关。同样，Lu的研究结果表明CLU rs11136000多态性可能不是AD易感性影响南方汉族人群的因素[16]。总之CLU基因rslll36000在不同人群及种族研究结果并不一致。

本研究未发现新疆汉族及哈萨克族CLU rs9331888位点(χ2=0.680，P=0.7954，χ2=1.111，P=0.574)与AD有关联性，我们的研究结果与Logue等[17]在非裔美国人中研究结果一致。有研究表明AD风险rs9331888基因与CLU血浆水平下降相关，它还修饰了CSF中微管相关蛋白的tau水平和Aβ(1～42)下降，其结果表明CLU内rs9331888多态性的次要等位基因(G)显著与LOAD风险增加有关，且在为期两年的随访研究中发现AD组中rs9331888处的SNPs与左侧海马体积显著相关(P=0.004)[18]。一项关于土耳其人的研究显示rs9331888与AD之间存在重要关系，GG基因型rs9331888可能增加发展AD的倾向，同时rs9331888的G等位基因与低凝聚素mRNA和血浆凝聚素水平相关；还观察到更高的血浆凝聚素水平及凝聚素 mRNA水平与较低的MMSE相关，这表明较高的凝血素水平与疾病严重程度相关[19]。有趣的是，一项在中国藏族人群研究发现rs9331888G基因可能降低AD的发病率[20]。不同种族的rs9331888位点验证研究目前结论尚不一致。本研究未发现其关联性可能的其他原因：(1)研究样本量相对较少，尚不能充分体现新疆哈萨克族人群整体基因分布情况；(2)在人群筛选方面，目前AD诊断仍以症状为主，诊断标准以各类心理学检测评分作参考，难免存在评分上的主观性造成误差；(3)新疆汉族及哈萨克族人群SAD可能与CLU 基因rs9331888位点多态性确实无关联。

总的来说，这是在新疆汉族及哈萨克族人中进行的为数不多相关性研究，研究发现CLU基因rs11136000位点多态性与SAD相关，携带T等位基因或者TT基因对降低哈萨克族人SAD发病率有一定作用，但汉族SAD与哈族SAD等基因型及等位基因比较差异均无统计学意义；CLU 基因9331888可能并非哈萨克族SAD的易感基因。