一把毫毛一群小猴

陈冰

重磅新闻！

继震惊世界的首批体细胞克隆猴“中中”“华华”诞生一年之后，上海科学家更进一步，宣布培育出世界首批遗传背景一致的非人灵长类疾病动物模型——生物节律紊乱体细胞克隆猴模型。

2019 年1 月24 日凌晨，两篇系列研究论文在线发表于中国顶级综合英文期刊《国家科学评论》。

1月24日，我国顶级综合英文期刊《国家科学评论》在线发表了相关系列研究论文。这一科学成果突破了利用活体猕猴体细胞克隆的难关，开启了标准化创建疾病克隆猴模型的新时代，有助于缩短药物研发周期，提高药物研发成功率，将极大地促进生命科学和医学发展。

在研究神经科学和脑科学的人员只有美国的十分之一，而科研经费只有美国的二十分之一的前提下，我国的体细胞克隆猴技术再次走到世界的最前列。“孙悟空拔一把毫毛变一群小猴的梦想，我们终于实现了！”中国科学院神经科学研究所所长蒲慕明院士表示，这次的克隆猴来自青年基因编辑猴的成熟体细胞，这使我国在建立非人灵长类动物模型的国际竞争中的领先优势进一步扩大。

生物节奏紊乱引发众多疾病

雄鸡报晓，蜘蛛半夜结网，向日葵在清晨开放……自然界所有生物的生命活动都存在节律现象，与地球24小時的自转周期保持同步对于生物维持健康的生理状态至关重要。经过长时间的研究，人们发现，其实生物的节律与基因密切相关，2017年的诺贝尔生理或医学奖就被奖励给了三位研究节律相关基因的科学家。

特别是现代社会，巨大的工作生活压力使人类的作息时间很难严格遵循于体内的生物钟。加班、轮班，频繁地跨越时区，熬夜玩手机等等，越来越多的人面临着生物钟紊乱的困扰，昼夜节律紊乱与睡眠障碍、神经退行性疾病（如阿尔茨海默症）、精神疾病（如抑郁症）、糖尿病、肿瘤，以及心血管疾病等密切相关。

然而，由于小鼠、果蝇等传统动物模型与人的昼夜活动周期、脑结构和代谢速率等存在显著差异，极大制约了生物节律紊乱相关疾病机理和诊治手段的研发。神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强指出，非人灵长类实验动物曾在人类攻克传染病等各种疾病中发挥重要的作用。并且非人灵长类动物与人类最接近，是研究节律紊乱相关疾病机理和诊治手段比较理想的动物模型，因此建立非人灵长类生物节律紊乱模型迫在眉睫。

通过研究，科学家们发现在哺乳动物的大脑中有一个控制生物节律的“起搏器”，这个“起搏器”是通过一系列节律基因调控昼夜节律，这些核心节律基因之一便是BMAL1。在此背景下，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心研究团队经过两年多的努力，首次利用CRISPR/Cas9方法，敲除了体外受精的猴胚胎中的生物节律核心基因BMAL1，产生了一批BMAL1缺失的猕猴，2016年中旬，五只BMAL1基因敲除的猕猴顺利诞生。

那么这些猴子有没有表现出周期紊乱的症状呢？

为此等到半年后小猴断奶，研究人员就从多个方面开始观察敲除猴的生物节律。研究人员给猴子们佩戴了“运动手环”，可以随时监测到它们的昼夜活动情况，发现敲除猴并未按照24小时的周期活动，在夜间活动明显增多，这说明敲除猴可能出现了失眠的问题。于是研究人员通过手术，在猴子背部皮下埋入记录脑电和肌电的植入子，分析其睡眠周期发现敲除猴的快速眼动睡眠（REM，浅睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明显减少。

在另一方面，研究人员通过搜集连续两天多个时间点的血液样本，对那些受节律调节的神经内分泌激素水平进行测定，发现帮助进入睡眠的褪黑素在敲除猴中分泌较少。同时研究人员还进行了基因表达谱分析，发现敲除猴的大多数节律基因表达异常，还有很多与睡眠剥夺，抑郁症以及衰老等相关的基因上调。

节律紊乱往往伴随着神经退行性疾病的发生，神经退行性疾病患者往往会遭受各种各样的睡眠问题，包括失眠、睡眠中断、日间过度嗜睡，继而出现睡梦中运动，白天与人交流出现障碍等等。但在之前，人们一直不太清楚这些究竟是睡眠紊乱的直接后果，还是长期失眠或服药的副作用。

从对这五只基因敲除猴的研究可以看到，猴子表现出怕人，避免与人对视等问题，而这些症状是以前在小鼠身上很难探测到的。

此外，有很多研究表明节律紊乱或睡眠障碍还是一些精神疾病，如双相情感障碍，抑郁症等症状。但是之前我们很难认定一只小鼠有抑郁或是双相情感障碍之类的问题，而这在灵长类身上就很明显了。研究人员在血液检测中发现与压力应激相关的皮质醇在敲除猴的血液中一直处于高水平，这让他们联想到敲除猴在与人接触时极度紧张的反应。当有人靠近敲除猴时，它会双手抱住头部，蜷缩在角落里，不敢活动。如果将敲除猴放入一个新环境中，它也不能很快地适应，不敢像正常猴那样在环境中自由探索。

研究人员还给猴子们做了一个经典的听觉刺激实验，在给出的一连串规律的声音中随机插入特殊的声音，记录猴子听到声音时的脑电，发现敲除猴大脑在识别和反应这些特殊事件的能力上不如正常猴，这与精神分裂患者的情况类似。

中科院神经所研究员张洪钧说，基因敲除后，出生不到一年的A6猴的睡眠就出现了接近衰老的现象，已与人类老年期类似。一年后又出现了焦虑、抑郁、精神分裂等严重症状，同时通过血液检测发现了激素水平异常。也就是说，有了遗传背景一致的疾病模型猴，就能研究相关发病生理指标，还可进行药物干预，这将大大推进相关疾病的研究。

张洪钧告诉记者，之所以如此大费周章构建基因敲除猴，最期望的就是在这些猴身上找到节律紊乱者的精神症状，这些才是非人灵长类较之小鼠等实验动物的真正优势。“BMAL1敲除小鼠的睡眠相比正常对照则是增多的，这也进一步说明了非人灵长类在脑疾病研究上的巨大优势。基因敲除猴为模拟人的节律紊乱相关疾病迈出了关键的第一步。

基因编辑克隆猴也得了精神病

通过敲除BMAL1基因获得的第一代模型猴还不算完美的动物模型，因为这些基因敲除猴属于“嵌合体”，体内不同细胞的基因型有差别，所表现出的症状严重程度不一致，不能作为理想的动物模型。那么，能否利用“中中”“华华”这样的克隆猴技术，构建出疾病模型猴呢？

“可以说是马不停蹄，我们很快投入到了新的任务中，在国际上首次获得了5只遗传背景一致的生物节律紊乱克隆猴。”中科院神经所孙强研究员介绍，最大的一只出生于2018年7月12日，已脱离人工哺乳，一紧张就会抱头，见了保育员就心跳加速，白天晚上无规律地睡眠——在神经所非人灵长类研究中心的孵育箱里，这只编号B1的食蟹猴断奶之后表现出了与本体基因编辑猴A6明显相同的生物节律紊乱症状。

接下来将研制系列疾病模型猴，包括抑郁症、帕金森症和阿尔茨海默症等脑疾病，这些脑疾病模型克隆猴，未来将有助于解析脑重大疾病的致病机理、确立预警和早期诊断指标、进行干预和治疗等。

孙强研究员指出，国际上通行的验证克隆动物的金标准是比对细胞核和线粒体基因。检测表明，这5只基因编辑克隆猴的细胞核基因型与核供体细胞完全一致，而线粒体基因型则与卵供体猴一模一样，同时它们的任何基因与生出它们的代孕妈妈彻底无关，非常符合克隆动物的鉴定金标准。

中科院神经所刘真研究员介绍，此次克隆有两个技术突破。第一，不同于“中中”“华华”从流产母猴的胚胎体细胞克隆而来，这次选择了1只一岁半、睡眠紊乱最明显的公猴来提供体细胞，被国际同行评价为“首次证实通过体细胞核移植技术可以克隆成年基因修饰猴”。尽管克隆技术路线是一致的，但在效率上略高于“中中”“华华”，这将在很大程度上打消人们对于克隆技术效率的担忧。第二，首次利用基因编辑猴的体细胞得到克隆后代。“中中”“华华”都是野生型猴，从疾病研究的角度来说，不如基因编辑猴的克隆后代，这也回答了“携带有特定基因编辑的体细胞是否可以用来克隆”的疑问。

“中中”、“华华”与此次研究所用的克隆猴流程示意图。科学家会先去除猴卵细胞的细胞核，然后在其中放入另一只猴的体细胞核，等待两者充分融合后，最后将这个核移植过的卵移植到代孕母猴体内等待克隆猴出生。

可以说，本次研究意味着克隆基因编辑猴技术由此从理论层面迈向了实践层面，鉴于目前克隆技术是制造基因编辑猴的成本最低、耗时最少的手段，而作为全球暂时唯一掌握克隆猴技术的神经所，有望在未来的神经科学研究中抢先一步。

药物研发周期缩短

“脑疾病的社会负担越来越大，平均每个脑疾病药物需耗费数十亿美元和10年以上时间，失败率大于90%。有了疾病猴模型，有望缩短药物研发周期，降低研发成本。”中科院神经所所长蒲慕明院士说。

人类很多与神经系统相关的疾病，如阿尔茨海默癥、自闭症、心脑血管疾病等，很难通过小鼠来模拟。“没有猴子作为实验动物模型，神经科学很难有实质性推进。”蒲慕明说，这就是神经所毕十年之功，全力攻克克隆猴及疾病模型猴这一难关的原因。

一个药物在临床前，需要在动物身上检验安全性、代谢情况和药效评估。通过近亲繁殖20代产生的小鼠，虽然没有遗传背景干扰，但由于和人的差异太大，许多神经类、精神类药物，即使90%在小鼠身上有效果，但到了临床还是无效或有副作用。国际上许多知名药企，每年用约10万只猕猴来做药物安全性和代谢检测，但由于没有合适的非人灵长类疾病模型，很难开展药效检测。“猕猴5到6年才能有一代，无法通过近亲繁殖手段得到遗传背景一致的实验猴，最好的办法就是克隆。”

“现在只是一个起点。”蒲慕明介绍，接下来将研制系列疾病模型猴，包括抑郁症、帕金森症和阿尔茨海默症等脑疾病，以及免疫缺陷、代谢紊乱、肿瘤等疾病。这些脑疾病模型克隆猴，未来将有助于解析脑重大疾病的致病机理、确立预警和早期诊断指标、进行干预和治疗等。“一年前，我认为国际同行追赶上我们的时间是一年，但这次论文发表后，我们在国际上的领先优势进一步扩大。”蒲慕明透露，目前美国、澳大利亚、以色列和欧洲一些国家都有科学家团队向神经所提出合作意向，很快将有多支国际科研团队全职入驻松江区，利用包括疾病克隆猴在内的非人灵长类模型开展前沿研究，这将为上海集聚起一批国际顶尖科学家。“建立基于疾病模型猴的非人灵长类平台，将成为中国脑计划的一大亮点。”

1月23日，中科院神经所和中科院上海药物所签订了战略合作框架协议，后者有20多种药物将进入临床，双方将共建非人灵长类药物筛选模型。目前，已有多家制药企业对疾病克隆猴表示了浓厚兴趣。未来，G60脑智科创基地将建立相关产业平台。