冷饭团对肝纤维化大鼠肝组织Bcl-2和Bax及PCNA表达的影响*

徐卫权，李艳

(湖北省宜昌市夷陵医院药剂科，宜昌 443100)

冷饭团为五味子科南五味子属植物冷饭团[Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith]的根和藤茎，主要分布在我国湖北、广东、广西、四川、云南、贵州等地。其味辛、微苦，性温。具有行气镇痛、散瘀通络的功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、胃病及妇科病等[1]。据研究，冷饭团具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗人获得性免疫缺陷病毒(HIV )等广泛的药理活性，并有较好的抗肝纤维化作用[2-3]。笔者在本研究旨在通过观察冷饭团对四氯化碳(CCl4)诱导实验性肝纤维化大鼠肝组织Bcl-2、Bax及增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen，PCNA)表达的影响，进一步探讨冷饭团的抗肝纤维化作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠，雌雄兼用，体质量180～200 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2010-0007。动物饲养室相对湿度50%～70%，温度20～23 ℃，大鼠自由饮水、摄食。

1.2药物与试剂 冷饭团[采自湖北省宜昌市夷陵区，经李文胜主任药师鉴定为五味子科植物冷饭团Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的藤茎]，切薄片，干燥，水煎2次，每次60 min，滤过，合并滤液，置水浴上浓缩至每毫升含生药0.25 g和0.5 g。秋水仙碱片(云南植物药业有限公司，批号：160713)，临用时研末，加纯化水配制成0.02 mg·mL-1混悬液。四氯化碳(郑州化学试剂二厂，批号：151109)。免疫组织化学一抗(兔抗大鼠多克隆抗体Bcl-2、兔抗大鼠多克隆抗体Bax、小鼠抗大鼠单克隆抗体PCNA，武汉博士德生物工程有限公司，批号：20160917)。免疫组织化学二抗(SAl021-小鼠IgG、SAl022-兔IgG、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，批号：20160917)。

1.3动物分组 将健康SD大鼠随机分成正常对照组、模型对照组、秋水仙碱组、冷饭团小剂量组、冷饭团大剂量组，每组12只。

1.4造模及给药 大鼠适应性饲养7 d后，除正常对照组外，其余大鼠皮下注射40%四氯化碳橄榄油溶液0.3 mL·(100 g)-1，每周星期一和星期四各注射1次，共6周。在实验过程中，除正常对照组大鼠用全价颗粒饲料喂养外，其余各组大鼠先用79.5%纯玉米粉、20%猪油和0.5%胆固醇制成的颗粒饲料喂养2周，再用89.5%纯玉米粉、10%猪油和0.5%胆固醇制成的颗粒饲料喂养至第6周末。同时灌服30%乙醇1 mL·(100 g)-1，每周2次，共6周。从实验第2天开始，均按10 mL·kg-1剂量灌胃给药，每日1次，共6周。其中，秋水仙碱组灌服0.02 mg·mL-1秋水仙碱混悬液，冷饭团小、大剂量组分别灌服0.25，0.5 g·mL-1冷饭团水煎液，正常对照组和模型对照组灌服等容积0.9%氯化钠溶液。

1.5检测指标及方法 实验第6周末，处死各组大鼠，仰卧位固定，在无菌操作下切开腹腔，摘取肝左叶组织，置于10%甲醛溶液中固定。固定后组织用流水冲洗，使用乙醇从低浓度到高浓度的顺序进行脱水，透明，石蜡包埋切片。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(S-P)，用已知阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。按试剂盒内说明书操作，对各组大鼠肝组织切片进行免疫组织化学染色。利用JEDA-801D形态学图像分析系统分别计算Bcl-2、Bax和PCNA免疫组织化学染色的阳性面积百分比。病理切片做苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色，光镜下观察组织形态学的变化和胶原纤维增生情况。

2 结果

2.1动物一般情况 除模型对照组大鼠死亡2只外，其余各组大鼠均存活。正常对照组大鼠生长良好，体质量自然增长，行走、活动、食欲和排便均正常。模型对照组大鼠生长受抑，体质量下降，活动减少，饮食下降。各治疗组大鼠生长较正常，体质量略有增长，活动较灵敏，反应较敏捷，饮食较正常。

2.2大鼠肝组织病理学观察 HE染色标本观察，正常对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，无变性坏死。模型对照组大鼠肝小叶结构严重破坏，肝细胞广泛脂肪变性，大部分标本可见不同程度的肝细胞坏死，肝组织中有炎症细胞浸润。秋水仙碱组肝细胞脂肪变性，汇管区及肝小叶可见少量炎症细胞浸润。冷饭团小剂量组和大剂量组肝小叶结构基本正常，肝小叶周边肝细胞有轻度脂肪变性，汇管区偶见少量淋巴细胞浸润。其肝细胞水肿、脂肪变性程度均比模型对照组轻。Masson染色标本观察，模型对照组大鼠肝组织内有大量纤维组织增生形成纤维间隔，胶原纤维从汇管区向肝小叶内延伸，其破坏界板，分割、包绕肝小叶，部分标本内可见完整的假小叶。秋水仙碱组肝组织内胶原纤维增生均比模型对照组轻，无假小叶形成。冷饭团小剂量组和大剂量组部分标本有轻度纤维组织增生，主要散在于中央静脉和汇管区。见图1。

2.3肝组织中Bcl-2、Bax和PCNA的表达 Bcl-2和Bax蛋白免疫组化的阳性表达呈棕黄色或深棕黄色，PCNA阳性着色呈棕黄色细颗粒状。见图2。模型对照组大鼠肝组织中Bcl-2、Bax和PCNA的表达均明显高于正常对照组(P<0.01)；与模型对照组比较，冷饭团大、小剂量组和秋水仙碱组大鼠肝组织中Bax蛋白的表达明显降低，PCNA的表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。见表1。

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经途径，及时诊断与治疗肝纤维化对阻止肝硬化的发生、改善慢性肝病的预后具有重要意义。四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型，是抗肝纤维化药物筛选及肝纤维化机制研究的理想模型，其病理改变与人类肝纤维化的形态特征相似[4]。本实验结果表明，大鼠经四氯化碳和高脂低蛋白等复合因素刺激6周后，其肝小叶结构被破坏，肝组织内出现广泛脂肪变性和炎性细胞浸润，纤维组织不同程度增生并将肝组织分成广泛的假小叶，说明大鼠肝纤维化模型复制成功。经秋水仙碱或冷饭团干预后，大鼠肝细胞坏死、肝脏脂肪变性、炎性细胞浸润和胶原纤维增生程度均不同程度地减轻。说明冷饭团具有一定的抗大鼠实验性肝纤维化作用。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.秋水仙碱组；D.冷饭团小剂量组；E.冷饭团大剂量组

A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.low-doseKadsuracoccineagroup；E.high-doseKadsuracoccineagroup

Fig.1Massonstainingimagesoflivertissuesinfivegroupsofrats(×50)

A.正常对照组；B.模型对照组；C.秋水仙碱组；D.冷饭团小剂量组；E.冷饭团大剂量组

A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.low-doseKadsuracoccineagroup；E.high-doseKadsuracoccineagroup

Fig.2Immunohistochemicalstainingoflivertissueinfivegroupsofrats(×400)

肝纤维化的发生、发展及转归与细胞凋亡和增殖有关。细胞凋亡是受多基因控制的过程，其中Bcl-2家族是目前最受重视的凋亡相关基因家族。Bcl-2和Bax同属Bcl-2基因家族，Bcl-2基因和Bax基因的相关蛋白Bcl-2蛋白和Bax蛋白可形成异源二聚体，Bax蛋白之间形成同源二聚体，且异源二聚体抑制细胞凋亡，而同源二聚体则促进细胞凋亡[5-7]。因此，Bcl-2和Bax两种蛋白之间的比值决定细胞的凋亡状态，若调高Bax/Bcl-2比值则促进细胞凋亡，而降低Bax/Bcl-2比值则抑制细胞凋亡。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，其合成与表达反映细胞的增殖状态。细胞动力学研究表明，PCNA的表达及合成与细胞增生周期有关，G1期PCNA逐渐增多，S期达高峰。因此，PCNA能准确地反映细胞的生长速度和状态，其表达上调则促进细胞的增殖[8]。本研究结果表明，肝纤维化模型大鼠肝组织中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达较正常大鼠显著升高，结果与文献[9]报道一致。提示肝组织在受到四氯化碳等因素的损伤刺激后，引起Bax的表达增加来诱导肝细胞的凋亡。在肝细胞发生凋亡后，机体可能通过代偿机制增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来对抗凋亡。经冷饭团或秋水仙碱干预后，大鼠肝组织中Bax蛋白的表达明显降低，Bax/Bcl-2比值降低，PCNA的表达显著升高。提示在冷饭团的干预下，肝细胞的凋亡减少，细胞的增殖速度加快，这有利于肝细胞的修复和维持数量的稳定，从而使肝细胞炎症减轻，肝纤维化进程得到遏制。因此，笔者认为冷饭团可能通过影响肝组织中Bax和PCNA的表达来调节肝细胞的凋亡和增殖水平，从而抑制和逆转肝纤维化。

表1 5组大鼠肝组织中Bcl-2、Bax和PCNA的表达

Tab.1 Expression of Bcl-2， Bax and PCNA of liver tissues in five groups of rats

表1 5组大鼠肝组织中Bcl-2、Bax和PCNA的表达

组别动物数/只剂量/(g·kg-1)Bcl-2BaxPCNA正常对照组12-3.69±1.07∗13.97±0.84∗15.53±1.12∗1模型对照组10-7.63±1.328.55±2.019.17±2.25秋水仙碱组120.00026.37±1.81 5.76±1.47∗213.56±3.04∗1冷饭团 小剂量组122.56.42±1.59 5.59±1.53∗214.89±2.97∗1 大剂量组125.05.96±1.38∗25.08±1.36∗115.06±3.10∗1

与模型对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.01，*2P<0.05