白桦BpSPL2基因启动子的克隆及表达分析

王晟宇 张 淇 张正一 胡晓晴 田 晶 张 勇 刘雪梅

(东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040)

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的一类转录因子，均具有含76个氨基酸的高度保守区段，以此同下游基因SQUAMOSA及其同源基因的启动子区域结合并调控表达，被命名为SBP结构域，包含2个锌指结构和一个核定位信号[1]。SPL基因在参与发育阶段转变[2]、花和果实发育[3～4]、孢子发生[5～6]、植株形态建成[7]等方面起着重要作用。近年来，在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)等模式植物中探索SPL功能已成为热点。

开花是高等植物从营养生长到生殖生长的一个重要转折点，受外界环境(光照、温度)和自身内部因素的影响。拟南芥中至少存在4条开花诱导途径,即光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主途径。SPL在植物开花调控网络中处于核心枢纽地位，能够整合光周期和赤霉素(GA)两条开花诱导途径。研究表明拟南芥SPL基因通过直接激活花分生组织特异基因LEAFY(LFY)，FRUITFUL(FUL)和APETALA1(AP1)从而促进植物营养生长向生殖生长过渡，它们构成一个内源性开花途径，可在短日照下不需经由光周期途径促进开花[8～10]。AtSPL8影响花药的发育而且参与调控GA的合成[5]，而AtSPL14作为负调控因子影响营养生长和开花的转换过程[11]。拟南芥AtSPL3基因主要在花序中表达,过量表达AtSPL3不仅会促进开花,而且在长日照和连续光照条件下还会导致花和花序发育异常。番茄LeSPL3在花序和花柄中大量表达，过量表达Le-SPL3基因会导致转基因烟草(Nicotianatabacum)花柄离区离层细胞层数增加,花更易脱落,表明LeSPL3可能调控花柄离区的发育。在苜蓿(Medicagosativa)中，SPL13直接靶向R2R3-MYB基因影响侧枝发育和开花时间[12]。此外，拟南芥SPL10的启动子在根中特异性表达，过表达该基因后，植物侧根发育受到抑制[13]。Lannenpaa等从欧洲白桦(Betulapendula)中克隆鉴定了BpSPL1，其在花序、芽和叶中均有表达，可特异性结合BpMADS5启动子[14]。这些结果表明，SPL基因在植物中有多种表达模式，对植物的营养生长和花发育调控起重要作用。

启动子(promoter)是一段提供RNA聚合酶特异识别和结合位点的DNA序列，可控制基因转录的起始时间和表达程度，通常位于基因转录起始位点近端的核苷酸序列上游区域内，主要由核心启动区、上游元件和应答元件组成[15]。组织特异性启动子能够驱动外源基因在植物组织器官中定时、定点表达，这样不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费，如毛果杨(Populustrichocarpa)PTLF基因启动子可驱动GUS基因在杨树叶脉、嫩枝顶端的扩展叶和叶原基中表达[16]；GUS荧光定量检测表明茶树(Camelliasinensis)Cpcp启动子片段在花粉中表达，都说明其具有组织特异表达特性[17]。因此，近年来，组织特异性启动子逐渐成为研究重点。

白桦(Betulaplatyphylla)属桦木科(Betulaceae)桦木属(Betula)，为喜光、适应性强、耐贫瘠、耐严寒和喜酸性土壤的落叶乔木[18]，雌雄同株异花，且花发育存在越冬宿存的现象[19]，是我国北方的主要用材树种，也是天然次生林的先锋树种，在天然林更替方面起到了重要作用[20]。白桦花发育模式与草本植物相比存在明显的差异，可能由其所特有的花发育基因调控路径所致[21]。探索影响开花发育的SPL基因启动子的表达活性将为揭示木本植物成花机理奠定基础。本文研究的BpSPL2基因(MF429834)与拟南芥AtSPL6/SPL13有较高的同源性，我们前期对BpSPL2基因转化拟南芥后出现花败育、侧枝数量增多的表型(暂未发表)，暗示其可能参与花器官形态发育。本文通过PCR扩增技术从白桦中得到BpSPL2启动子序列，并进行顺式作用元件分析，构建pBI121-pBpSPL2-GUS表达载体，并用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导瞬时转化白桦和拟南芥，对GUS活性进行特异性分析。

1 实验材料与方法

1.1 白桦基因组总DNA的分离

以白桦组培幼苗为材料提取白桦基因组总DNA(DNA提取试剂盒购于天根公司)。

1.2 引物设计与PCR扩增

根据白桦基因组信息(http://birch.genomics.cn/page/species/index.jsp)设计引物扩增白桦BpSPL2基因上游1 960 bp的基因序列，并由吉林省库美生物科技有限公司合成。其中上游引物：BpSPL2-promoter1F序列为TGGAATAGAATCAAAGTCGC；下游引物：BpSPL2-promoter1R序列为CTCAAGTTTATCGGTCATGT。50 μL PCR反应体系包括：2.5 μL白桦基因组DNA、5 μL 10×PCR Buffer(for KOD-Plus-Neo)、各1.25 μL上下游引物、3 μL 2.5 mmol·L-1MgSO4、31 μL无菌水、5 μL 2 mmol·L-1dNTPs以及1 μL KOD-Plus-Neo(TOYOBO)。PCR反应条件为：预变性94℃ 5 min，变性98℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，30个循环；72℃再延伸7 min后中止反应。

1.3 目的片段克隆及测序分析

PCR产物利用1%(g/v)琼脂糖凝胶电泳检测，加A尾后使用试剂盒(天根公司)回收、纯化目的片段，克隆目的片段于pMD18-T载体上(Invitrogen)，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，送由吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.4 启动子序列分析

利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析软件，对克隆得到的BpSPL2基因启动子序列进行元件分析。

1.5 植物表达载体构建

根据BpSPL2基因启动子序列设计酶切引物，F:GCGGATCCGGAATAGAATCAAAGTCGC(下划线标记为BamHⅠ酶切位点)，R:GCAAGCTTCTCAAGTTTATCGGTCATGT(下划线标记为HindⅢ酶切位点)。从1.3中获得的阳性克隆菌株中提取质粒，用酶切引物进行PCR胶回收后，同时将启动子和植物表达载体pBI121-GUS进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收纯化的目的片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经抗性筛选和菌落PCR检测获得阳性克隆，提取阳性重组质粒DNA，进行PCR鉴定，获得重组植物表达载体，命名为pBI121-BpSPL2 promoter::GUS。

1.6 菌液的制备及转化

通过冻融法将pBI121-BpSPL2 promoter::GUS表达载体转化到根癌农杆菌EHA105中。挑取农杆菌单菌落在5 mL的LB液体培养基中28℃过夜培养，次日上午将该菌液用新鲜LB稀释至OD值0.1左右，然后再进行培养，待菌液至OD600为0.6～0.7时，3 000 r·min-1离心10 min收集菌体，用于拟南芥和白桦的瞬时侵染。拟南芥转化方法参照郭勇等[22]，白桦转化方法参见李萌等[23]。每个试验取10个植株，重复3次。

1.7 GUS染色

X-GLUC染色液配制(100 mL)：200 mmol·L-1的pH=7.0的磷酸缓冲液50 mL；100 mmol·L-1的Na2EDTA溶液10 mL；5 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]10 mL；5 mmol·L-1的K4[Fe(CN)6]10 mL；0.1% Triton-100；X-Gluc 60 mg，然后加水定容至100 mL。

将侵染处理后的拟南芥和白桦幼苗分别放入50 mL离心管中，各加入GUS染色液浸没植株，37℃恒温黑暗中过夜染色，再用V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1脱色液脱色约1 h，其间适时更换脱色液，然后取出，观察染色结果。

2 结果与分析

2.1 白桦BpSPL2基因上游序列的获得

通过PCR得到大小约为2 000 bp的条带，与预期片段大小相近。电泳分离回收后克隆至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR能得到长度一样大小的DNA片段，经过测序对比后，与在白桦基因组中查找的序列一致，说明该基因片段已经克隆入pMD18-T载体。

图1 PCR产物电泳图谱 M.DL-5000 Marker；1.PCR产物Fig.1 Electrophoretogram of PCR product M. DL-5000 Marker; 1. PCR product

2.2 白桦BpSPL2基因启动子序列分析

利用PLACE和PlantCARE在线软件对启动子序列进行分析，发现该序列中除了含有启动子的基本转录元件TATA-box、CAAT-box，同时还含有其它多种作用元件。其中包括3种脱水响应元件(MYCATRD22、MYCCONSENSUSAT、ACGTATERD1)，3种伤害响应元件(DOFCOREZM、WBOXNTERF3、WBOXATNPR1)，2种激素响应元件(ARR1AT、WRKY71OS)，2种光调控相关元件(IBOXCORE、GATA-box)，1种低温响应元件(MYCCONSENSUSAT)等。

值得注意的是，该启动子同时含有2种与花粉特异性表达有关的顺式作用元件POLLEN1LELAT52(AGAAA)和GTGANTG10(GTGA)，其中AGAAA序列有4个，GTGA序列有4个。由此可以推测，该基因启动子在某个时期可能驱动基因参与白桦的开花调节，非生物胁迫响应，激素响应及光响应等生物学过程中。具体的作用元件名称、元件序列、个数及其生物学功能如表1所示。

2.3 植物表达载体的构建

将BpSPL2启动子和pBI121载体质粒分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收纯化目的片段，通过T4DNA连接酶连接。新的重组质粒经菌液PCR检测后得到2 000 bp左右的单一条带(图2)。经测序比对后验证连接正确，植物表达载体pBI121-BpSPL2 promoter::GUS构建成功(图3)。

图2 白桦BpSPL2基因启动子序列Fig.2 Promoter sequence of BpSPL2 gene for B.platyphylla

元件名称Element names基序序列Motif sequences个数Numbers生物学功能FunctionTATA-boxTATA15核心启动元件Core actuating elementCAAT-boxCAAT13启动子增强区保守元件Conservative element of promoter enhance regionPOLLEN1LELAT52AGAAA4花粉特异表达的顺式作用元件Cis-acting element for pollen specific expressionGTGANTG10GTGA4花粉特异表达的顺式作用元件Cis-acting element for pollen specific expressionCURECORECRGTAC2铜离子响应元件Copper ion responsive elementIBOXCOREGATAA1光调控相关元件Optical control related elementGATA-boxGATA5光调控相关元件Optical control related elementMYCATRD22CACATG1脱水及ABA响应元件Dehydration and ABA response elementMYCCONSENSUSATCANNTG14脱水及寒冷响应元件Dehydration and cold response elementTATABOX5TTATTT6启动子保守序列The promoter conservative sequencecircadianCAANNNNATC1生理周期调控元件Physiological cycle control elementARR1ATNGATT12细胞分裂素响应元件Cytokinin response elementWRKY71OSTGAC2赤霉素响应元件Gibberellin response elementDOFCOREZMAAAG14伤害响应元件Damage response elementWBOXNTERF3TGACY1伤害响应元件Damage response elementWBOXATNPR1TTGAC1伤害响应元件Damage response elementCCAAT-boxCCAAT2热激信号响应元件Heat shock signal response elementSkn-1-motifGTCAT1胚乳表达调节元件Endosperm expression regulatory elementACGTATERD1ACGT2与脱水有关的基因作用元件Gene action element related to dehydration

注:基序序列：Y=C/T，N=A/T/G/C

Note: Motif sequences:Y=C/T，N=A/T/G/C

图3 农杆菌重组质粒的PCR检测 M.DL-5000 Marker；1～10.阳性鉴定产物Fig.3 PCR result of positive Agrobacterium tumefaciens clone M.DL-5 000 Marker; 1-10.Positive identification product

图4 白桦pBI121-BpSPL2 promoter::GUS植物表达载体的构建Fig.4 Construction of pBI121-BpSPL2 promoter::GUS plant expression vector of B.platyphylla

2.4 白桦BpSPL2基因启动子在白桦中的表达活性

为了研究BpSPL2启动子的表达特征，我们将构建好的pBI121-BpSPL2 promoter::GUS表达载体分别瞬时转化至白桦和拟南芥，然后进行GUS染色分析。

以白桦组培苗为受体，采用农杆菌介导的瞬时表达法对启动子活性进行分析，结果表明，经过BpSPL2-GUS侵染的白桦幼苗的根、茎、叶及芽经GUS染色后均呈蓝色(图5A)，其中以幼叶、芽及根部的GUS染色较深，说明GUS基因在上述组织中的表达量较高，未转化材料即阴性对照无任何GUS表达活性。

2.5 白桦BpSPL2基因启动子在拟南芥中的表达活性

对含有pBI121-BpSPL2 promoter::GUS报告载体的拟南芥植株进行染色，观察启动子启动活性及组织表达特异性。经GUS染色后的对照组未显蓝色。经含有目的启动子的表达载体工程菌液侵染后，植株的花、叶片、根部呈现蓝色(图6)，其中以花中的表达活性最为显著。解剖GUS染色后的花器官发现，BpSPL2基因启动子在花瓣、花药、雌蕊中强烈表达，在萼片中微量表达(图7)。表明克隆获得的白桦BpSPL2基因1 960 bp启动子区具有驱动GUS表达活性的能力，在根、叶片和花中均具有表达活性。

3 讨论

白桦(Betulaplatyphylla)为雌雄同株，单性花，

图5 白桦GUS组织特异性染色植株 A. pBpSPL2::GUS农杆菌侵染后白桦的GUS染色；B.未经侵染的野生型白桦GUS染色Fig.5 Tissue-specific staining of GUS in B.platyphylla A. GUS staining of infected B.platyphylla; B. GUS staining of control group

图6 拟南芥GUS组织特异性染色植株 A. pBpSPL2::GUS农杆菌侵染后的拟南芥GUS染色；B.未经侵染的野生型拟南芥GUS染色Fig.6 Tissue-specific staining of GUS in A.thaliana A. GUS staining of infected A.thaliana; B. GUS staining of control group

图7 拟南芥花器官GUS染色结果 A. pBpSPL2::GUS农杆菌侵染后的拟南芥花器官GUS染色；B.未经侵染的野生型拟南芥花器官GUS染色Fig.7 GUS expression in floral organs of A.thalianaA. GUS expression in floral organs of infected A.thaliana; b. GUS expression in floral organs of control group

雄花发育非常特殊，发育周期长达近一年，并以单核小孢子越冬，是一种研究单性花发育的理想试材。对白桦花发育的研究可以为今后进行白桦花发育的分子调控、定向培育及遗传改良提供理论依据，也可为具有较长生殖周期的林木花发育机制提供参考信息。BpSPL2是白桦SPL基因家族的一员，SPL基因家族在植物花发育中起重要作用[6]。相较于其他拟南芥SPL基因，BpSPL2与AtSPL6、AtSPL13基因具有较高的同源性。AtSPL6在先天免疫中起重要作用，它能够与核定位的免疫受体结合激活防御基因的转录[24]。过表达AtSPL13能部分恢复spl8花药败育的表型，原位杂交实验表明AtSPL13在花药发育的第五阶段的绒毡层细胞中表达[25]。

pBpSPL2-GUS在拟南芥花药中具有较高的表达活性(图7)，这暗示BpSPL2基因可能具有与AtSPL13相似的参与花药发育的功能。同样，与BpSPL2同源性较高的亮叶桦BlSPL11在雄花序发育的中间阶段也具有较高的表达量[26]。

顺式作用元件是同一DNA分子中具有特殊功能的转录因子DNA结合位点和其它调控基序，在基因转录起始调控中起重要作用。BpSPL2基因启动子区域除了含有启动子的基本转录元件TATA-box、CAAT-box，同时还含有其它多种作用元件。其中包括激素响应元件(ARR1AT、WRKY71OS)，光调控相关元件(IBOXCORE、GATA-box)，胚乳表达必须的顺式调控skn-1元件及花粉特异表达相关的顺式元件POLLEN1LELAT52和GTGANTG10元件。对生殖生长阶段各组织器官的生长发育起调控作用的BpMADS12[27]和BpCUC2[28]基因启动子中存在多个POLLEN1LELAT52和GTGANTG10元件。另外，BpSPL2基因启动子还包含多个脱水及寒冷响应元件、伤害响应元件，与BpSPL2基因同源的苜蓿SPL13被报道参与干旱胁迫[29]，因此推测BpSPL2基因有可能参与非生物胁迫应答反应。

启动子顺式作用元件分析为揭示白桦BpSPL2基因的功能提供了方向，而该基因的生物学功能还有待进一步深入研究。