Nrf2基因多态性与糖尿病视网膜病变的相关性研究

李 曼，任勇刚，张 淼

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常见的并发症之一，也是成年人致盲最主要的病因之一[1]。研究结果显示严格控制血糖、血压、血脂等危险因素能有效延缓和减轻糖尿病患者DR等并发症的发生和发展，但不能彻底阻止其发生，同时还存在部分患者代谢控制不良却不发生DR，提示DR可能是由环境和遗传多因素交互作用所致[2]。近年来相继有研究发现维甲酸X受体基因、醛糖还原酶基因、血管紧张素转化酶基因和糖基化终末产物受体基因等与DR发生密切相关。越来越多研究证据表明氧化应激可能与DR发病及进展均密切相关[3-4]，氧化应激可导致细胞膜完整性破坏，通过刺激细胞凋亡，加速微血管损害和血-眼屏障破坏，进而参与DR的发生、发展过程。核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是细胞氧化应激损伤的重要保护性因子，近年来不断有研究发现Nrf2-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路可能参与DR发病过程[5-6]。Xu等[7]研究发现Nrf2基因多个单核苷酸多态性位点与糖尿病发病无明显关联性，但与并发症发生密切相关。徐晓红[8]也发现Nrf2基因多态性可能与糖尿病血脂异常及并发症相关。然而，两项研究均未就Nrf2基因多态性与DR易感性的相关性进行观察。本研究以我国陕西汉族人群为研究对象，观察Nrf2基因多态性与DR的相关性，为临床工作提供参考。

表1各组基本临床特征比较

组别例数男性(例,%)年龄(x±s,岁)病程(x±s,a)BMI (x±s,kg/m2)吸烟(例,%)高血压(例,%)使用胰岛素(例,%)对照组12067(55.8)62.5±10.2-24.3±2.936(30.0)28(23.3)-DWR组18192(50.8)63.8±8.914.5±5.823.9±2.754(29.8)40(22.1)98(54.1)PDR组6238(61.3)61.5±11.115.3±5.224.1±3.321(33.9)14(22.6)35(56.5)NPDR组14387(60.8)61.8±8.514.8±4.824.5±3.150(35.0)30(21.0)80(55.9)F/χ24.0281.6110.5451.1941.2840.2180.153P0.2580.1860.5820.3120.7330.9750.926组别空腹血糖 (x±s,mmol/L)糖化血红蛋白(x±s,%)TG(x±s,mmol/L)TC(x±s,mmol/L)LDL-C (x±s,mmol/L)HDL-C (x±s,mmol/L)对照组5.3±1.55.5±2.01.9±1.55.3±2.73.2±1.41.2±0.3DWR组8.3±2.6a7.1±2.2a2.3±1.65.5±2.43.4±1.61.2±0.3PDR组8.8±3.2a7.8±2.6a2.2±2.25.8±3.03.5±1.81.1±0.4NPDR组9.2±2.7a,c7.3±2.3a2.2±1.85.2±2.33.6±1.51.1±0.4 F60.11020.8641.1380.9841.1082.175P<0.01<0.010.3360.4020.3470.090

注：对照组：健康志愿者；aP<0.05vs对照组；cP<0.05vsDWR组。

1对象和方法

1.1对象选择2016-01/2017-01于我科门诊和(或)住院治疗的2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)患者，T2DM诊断均符合2013年中华医学会糖尿病学分会制定的2型糖尿病诊断标准[9]，且排除胰岛细胞抗体，或胰岛素抗体，或谷氨酰胺脱羧酶抗体阳性，以及胰岛素释放试验胰岛素水平低下的患者。参照2014年我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南[10]将T2DM组患者分为无视网膜病变(diabetic without retinopathy，DWR)组，增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)组和非增殖期DR(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)组，其中DWR组共181例患者，包括男92例，女89例，平均年龄63.8±8.9岁；PDR组共62例患者，包括男38例，女24例，平均年龄61.5±11.1岁；NPDR组共143例患者，包括男87例，女56例，平均年龄61.8±8.5岁。选取同期在我院健康体检的120例无糖尿病及视网膜疾病的志愿者作为对照组，其中男67例，女53例，平均年龄62.5±10.2岁。所有入组人员均为汉族，彼此无血缘关系。本研究通过本院伦理委员会审核批准，所有入组成员均充分知情同意。

1.2方法临床资料收集包括年龄、性别、体质量指数(body mass index，BMI)、吸烟史、血压及糖尿病病史等基本信息，也包括眼科检查及实验室检查结果，眼科检查包括验光、小孔视力及裂隙灯显微镜检查，实验室检查包括血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)等。

基因多态性检测:采集清晨空腹时外周静脉血用于实验室检查，部分样本采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取全血基因组DNA。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)联合DNA直接测序法检测Nrf2基因启动子rs6721961位点单核苷酸多态性。PCR反应体系(25μL)包括： 10×Buffer 2.5μL，上、下游引物各1μL(上游：5’-GGGTTCCCGTTTTTCTCCCAGCTCTGGGTG-3’；下游：5’-TGTTTGCGAAGGTCGCTGGAGTTCGGACGC-3’)，dNTP混合物2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板DNA 1μL，不足部分由灭菌蒸馏水补足。反应条件为95℃预变性4min，然后按照变性95℃ 20s、退火65℃ 30s、延长72℃ 50s的顺序循环30周期，最后72℃延长3min。取0.5μL延伸产物，经1%琼脂糖凝胶电泳确定，对PCR产物直接测序。

2结果

2.1各组间基本临床资料比较四组的性别和年龄差异均无统计学意义，另外在病程，BMI，吸烟，高血压，使用胰岛素情况，TG，TC，LDL-C和HDL-C等指标四组间差异均无统计学意义。DWR组，PDR组和NPDR组分别与对照组比较，空腹血糖及糖化血红蛋白水平差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1rs6721961基因型判读。

表2各组Nrf2基因型和等位基因分布

分组例数C/CC/AA/ACA对照组12063(52.5)44(36.7)13(10.8)170(70.8)70(29.2)DWR组18198(54.1)65(35.9)18(9.9)261(72.1)101(27.9)PDR组6224(38.7)24(38.7)14(22.6)72(58.1)52(41.9)NPDR组14360(42.0)55(38.5)28(19.6)175(61.2)111(38.8)分组C/COR(95% CI)PC/AOR(95% CI)PA/AOR(95% CI)PCOR(95% CI)PAOR(95% CI)P对照组vs DWR组1.0-0.950(0.578～1.560)0.8390.890(0.480～1.943)0.7701.0-0.940(0.655～1.348)0.736对照组vs PDR组1.0-1.432(0.722～2.839)0.3032.827(1.162～6.879)0.0191.0-1.754(1.116～2.757)0.014对照组vs NPDR组1.0-1.313(0.772～2.232)0.3152.262(1.072～4.772)0.0301.0-1.540(1.068～2.221)0.020DWR组vs PDR组1.0-1.508(0.790～2.879)0.2123.176(1.386～7.275)0.0051.0-1.866(1.221～2.853)0.004DWR组vs NPDR组1.0-1.382(0.854～2.238)0.1882.541(1.295～4.983)0.0061.0-1.639(1.178～2.281)0.003PDR组vs NPDR组1.0-0.917(0.467～1.798)0.8000.800(0.360～1.776)0.5831.0-0.878(0.572～1.348)0.553

注：对照组：健康志愿者。

表3Logistic多因素回归分析

变量BS.EWaldOR95%CIP性别1.1521.1401.0213.1640.339～29.5550.217年龄0.7110.6851.0772.0360.532～7.7960.179空腹血糖1.1360.4626.0493.1151.260～7.7030.004糖化血红蛋白1.0370.4635.0172.8221.138～6.9930.007A等位基因0.4270.1389.5551.5321.169～2.0080.014

2.2Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果Nrf2基因rs6721961位点基因型包括C/C，C/A和A/A三种，本研究各组rs6721961位点基因型分布经检验均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，具有群体代表性，见图1。

2.3各组rs6721961位点基因型和等位基因分布频率及其与DR的关系DWR组与对照组比较，位点基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义(P>0.05)；PDR组和NPDR组分别与对照组和DWR组比较，突变纯合子(AA基因型)和突变基因(A等位基因)分布频率差异均有统计学意义(P<0.05)。PDR组和NPDR组比较，基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.4Logistic多因素回归分析将PDR组和NPDR组合并，对照组与DWR组合并，采用Logistic多因素回归分析，校正性别、年龄、空腹血糖及糖化血红蛋白等混杂因素，rs6721961位点A等位基因与DR相关(OR=1.532, 95%CI： 1.169～2.008,P=0.014)，见表3。

3讨论

高血糖状态下，蛋白激酶C途径、多元醇途径及氨基己糖途径等多条途径可被激活，使细胞氧自由基产生增多，同时还原性谷胱甘肽等抗氧化剂被大量消耗，机体氧化/抗氧化平衡被打乱，处于氧化应激状态[3-5]。视网膜作为一种高耗氧组织，较其他组织更容易受到氧化应激损伤。Xu等[5]研究发现高糖条件下，视网膜Müller细胞和血管内皮细胞生成超氧化物明显增多，细胞凋亡增加，加入抗氧化剂后，细胞凋亡可被抑制。还有临床研究结果显示DR患者血清中脂质过氧化物水平明显高于DWR患者，而DWR患者与正常对照组比较，血清脂质过氧化物水平差异无统计学意义[11]。这些研究证据均提示氧化应激在DR发生及进展过程中发挥重要作用。

Nrf2是体内介导抗氧化应激反应最主要的细胞防御机制之一，氧化应激刺激可激活胞浆中的Nrf2分子，促使Nrf2立即转位至细胞核内，与ARE结合，调节下游基因表达，包括多种与机体抗氧化相关基因，发挥稳定抗氧化作用[12]。近年来，不断有研究发现Nrf2与DR密切相关，Nrf2表达减少可能是DR发病的重要原因之一，激活Nrf2表达可能是未来治疗DR的重要途径[6]。有研究发现Nrf2基因敲除的小鼠视网膜色素上皮细胞存在退行性病理改变[13]，还有研究以Nrf2基因敲除小鼠构建视网膜缺血-再灌注损伤模型，发现Nrf2对视网膜缺血-再灌注损伤具有保护作用[14]。此外，血色素氧化酶-1作为Nrf2-ARE途径下游重要表达产物，也被发现与DR病变过程中视网膜神经元损伤相关。

然而，目前关于Nrf2基因多态性与DR易感性的相关研究鲜有报道，Xu等[7-8]学者研究发现Nrf2基因多个位点与糖尿病患者并发症发生密切相关，但均未单独就DR与Nrf2基因多态性进行分析。本研究选择的Nrf2基因rs6721961 C→A多态性位点位于启动子上游，可通过调控转录的方式来影响Nrf2表达和活性，已被证实与动脉粥样硬化、癫痫、帕金森等多种病理改变或疾病易感性相关[15-16]。同时该位点在中国汉族人群中存在广泛变异，适合作为基因多态性研究的位点。本研究结果显示对照组rs6721961位点A等位基因频率为29.2%，与既往国人研究结果相符[15-16]。Logistic多因素回归分析结果显示rs6721961位点A等位基因均是T2DM患者发生DR的危险因素，表明Nrf2基因rs6721961多态性与DR易感性密切相关，对于进一步证实Nrf2-ARE通路在DR发病过程中的作用，同时提示对于存在rs6721961位点A等位基因，尤其A/A基因型的T2DM患者，更加需要注意DR的预防，加强血糖管理。本研究还发现PDR组和NPDR组rs6721961位点基因型和等位基因分布频率差异均无统计学意义，提示rs6721961多态性可能与DR进展过程无关，但遗憾本研究未对纳入研究对象血清Nrf2水平进行测量，无法评估Nrf2本身与DR进展是否关联，需要后续研究进一步证实。

综上所述，Nrf2基因rs6721961多态性可能与DR易感性密切相关，但本研究纳入对象有限，需要更多相关研究结果验证。而且，Nrf2基因包括多个SNP位点，对于其他位点多态性与DR易感性的关系，以及多个位点之间的相互关系尚不明确，也需要后续进一步研究。