息肉状脉络膜血管病变患者房水中IL-8及其受体的表达

李 臻，王少杰，刘国立，简 瑞

0引言

息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)属于临床常见视网膜病变，调查显示在亚洲PCV发病率为60%～90%，患者多出现渗出型视网膜脱离及视网膜出血，严重者导致视力损害[1]。PCV发病原因及危险因素目前尚不明确，多数研究认为PCV是环境、遗传、生物因素相互作用的结果[2]。近期研究证实，病理性血管形成是导致PCV发生的直接原因，在受到外界刺激后内皮细胞过度增殖，导致新生血管形成[3]。研究证实白介素-8(interleukin-8，IL-8)为血管生成因子，且其受体CXCR1、CXCR2也参与血管形成，三者在内皮细胞生长中发挥重要作用[4]。然而IL-8是否参与PCV的发生，目前尚不明确。因此本研究通过检测PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平，以明确其在PCV发生中的作用。

1对象和方法

1.1对象选择2016-04/2018-03在本院进行治疗的PCV患者67例作为研究对象，其中男45例，女22例；左眼32眼，右眼35眼；年龄45～84(平均60.84±6.14)岁；病程1～24(平均10.36±2.48)mo；单息肉37例，多息肉30例。纳入标准：(1)视网膜出现红色、橘黄色结节病灶；(2)吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)检测黄斑区发现典型息肉病灶，且伴脉络膜血管网；(3)光相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)检测显示浆液性出血性视网膜色素上皮层脱离。排除标准：(1)青光眼、白内障、视网膜病变、角膜病变者；(2)病理性近视、年龄相关性黄斑变性等脉络膜新生血管疾病者；(3)近期内接受抗血管内皮生长因子(VEGF)、光动力疗法及手术治疗者；(4)心、肝、肾脏等严重受损者。另选取同期在本院进行治疗的50例白内障患者作为对照组，其中男32例，女18例；年龄39～80(平均60.57±6.14)岁；排除合并青光眼、视网膜脉络膜疾病者。两组研究对象的年龄、性别构成比等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得医院伦理委员会批准同意，研究对象均知情同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1样本采集PCV组患者在进行玻璃体腔注射前抽取房水150μL；对照组患者在进行白内障手术治疗前抽取房水150μL，所有样品均保存在-80℃冰箱中备用。

1.2.2实时荧光定量PCR检测房水中IL-8、CXCR1、CXCR2表达参照RNA提取试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific)说明书提取房水总RNA，并反转录为cDNA，用Primer3软件设计荧光定量PCR引物，见表1。反应体系(20μL)：2×SYBR Mix 10μL，10倍稀释cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL，H2O 8μL。每个样品设置3个重复孔。在Rotor-Gene3000 real-time PCR仪(德国QIAGEN公司，型号：Rotor-Gene Q)上进行反应，程序设定为：95℃ 预变性10s，95℃ 10s，62℃ 20s，72℃ 2min，共35个循环。反应结束后保存数据，利用仪器自带软件分析数据，采用2-ΔΔCt法计算IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA相对表达量。

1.2.3最佳矫正视力和中心凹视网膜厚度检测所有患者入院后均采用国际标准视力表测量最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)，并换算为LogMAR视力。

表1引物序列

基因引物序列(5-3)IL-8ForwardATGACTTCCAAGCTGGCCGTGReverseCTCTTCAAAAACTTCTCCCXCR1ForwardGAGGTTGTGTGTGGAAGGTGReverseAGGTTGATGTTTTGGCAGTGCXCR2ForwardTGGGCAACAATACAGCAAACTReverseGCACTTAGGCAGGAGGTCTTAβ-actinForwardTCCTCCCTGGAGAAGAGCTAReverseTCAGGAGGAGCAATGATCTTG

组别IL-8CXCR1CXCR2PCV组1.25±0.061.46±0.041.33±0.09对照组0.57±0.130.42±0.110.48±0.12t37.79871.40543.798P<0.001<0.001<0.001

注：对照组：白内障患者。

采用OCT扫描仪检测中心凹视网膜厚度(central macular thickness，CMT)，扫描时以中心凹视网膜为主，采用6mm×6mm 3D模式，纵向、横向分辨率分别为3.87、11.4μm，扫描深度设定为2mm，记录CMT，每位患者重复测量3次，取平均值。

2结果

2.1两组患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2mRNA水平比较与对照组相比，PCV组患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2 mRNA表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.001)，见表2。

2.2两组患者BCVA和CMT的比较对照组患者BCVA(0.09±0.02)显著优于PCV组(0.19±0.02)，CMT(266.86±20.42μm)显著低于PCV组(386.15±21.79μm)，差异均有统计学意义(t=26.755、30.085，均P<0.001)。

2.3PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平与BCVA、CMT的相关性分析PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2水平与BCVA(LogMAR)呈正相关(r=0.438，P<0.01；r=0.346，P=0.013；r=0.385，P=0.002)，与CMT呈正相关(r=0.378，P=0.005；r=0.606，P<0.01；r=0.357，P=0.011)，见图1。

2.4影响PCV发生的多因素分析以PCV发生作为因变量，将年龄、性别、IL-8等指标作为自变量进行Logistic多因素回归分析，结果显示IL-8、CXCR1、CXCR2、BCVA、CMT是影响PCV发生的危险因素，见表3。

图1PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2与BCVA、CMT相关性分析。

图2IL-8、CXCR1、CXCR2诊断PCV的ROC曲线。

表3影响PCV发生的多因素Logistic回归分析

变量βSEWald χ2POR95%CI年龄0.1280.2490.2640.1891.1371.106～1.169性别0.1690.1152.1600.0741.1841.059～1.323CMT0.5660.4271.7570.0191.7621.349～2.302BCVA0.6130.4391.949<0.0011.8461.156～2.947IL-80.7830.5262.216<0.0012.0531.687～2.498CXCR10.8510.4094.329<0.0012.3411.368～4.006CXCR20.7970.4321.844<0.0012.2191.336～3.685

2.5IL-8、CXCR1、CXCR2对PCV的诊断价值ROC曲线分析显示，IL-8、CXCR1、CXCR2对PCV具有一定诊断价值。IL-8诊断PCV的曲线下面积(AUC)为0.882(P<0.01)，敏感性为80.60%，特异性为88.06%；CXCR1诊断PCV的AUC为0.860(P<0.01)，敏感性为76.11%，特异性为83.58%；CXCR2诊断PCV的AUC为0.812(P<0.01)，敏感性为71.64%，特异性为85.07%，见图2、表4。

3讨论

PCV属于一种特殊眼底疾病，病情严重则会影响患者视力，甚至导致失明，近年来我国发病率逐年升高[5]。PCV发病机制较复杂，具体机制尚不明确。研究认为，

表4IL-8、CXCR1、CXCR2对PCV的诊断价值

检测指标AUC标准误95%CIZPIL-80.8820.0330.847～0.91612.203<0.01CXCR10.8600.0290.809～0.9232.085<0.01CXCR20.8120.0430.746～0.8557.171<0.01

PCV 息肉状的病灶主要与色素上皮发生慢性退行性变、炎症反应有关，也有研究发现眼局部的一些细胞因子和趋化因子会在PCV发病过程中发生变化[6-7]。赵敏等[8]研究显示，PCV发病过程中，外周血中的趋化因子、血管形成因子均发生异常。IL-8参与血管内皮形成、血管炎症反应，而其是否与PCV有关，目前未见报道，因此本研究以IL-8为切入点探索PCV的发病机制，为PCV的治疗提供新线索和新靶标。

IL-8属于趋化因子家族成员，能够通过不同方式调控血管形成。研究证实，IL-8与肿瘤转移、血管形成密切相关[9]。体外研究显示，无炎症发生情况下，内皮细胞培养时添加IL-8能够诱导血管内皮细胞发生增殖及趋化反应[10]。动物实验研究显示，IL-8可直接诱导血管形成[11]。另有研究显示，转染IL-8的肿瘤细胞可迅速生成新生血管[12]。Choi等[13]认为，IL-8为血管形成的重要因子，体外培养微血管内皮细胞诱导其凋亡时，添加IL-8后能够使凋亡细胞数量明显减少，此外IL-8能够刺激内皮血管细胞增殖。以上研究均提示IL-8与血管形成、血管病变密切相关。本研究结果显示，PCV患者房水中IL-8 mRNA表达明显升高，表明房水中IL-8的异常可能与PCV有关。张亚芳等[14]发现PCV患者血清中IL-8水平与正常者并无明显差异，这与本研究结果不一致，分析原因可能为PCV病变后房水中IL-8进入血清后其水平可能受到其他因素影响，因此造成血清IL-8水平无差异。进一步研究发现，PCV患者房水中IL-8水平与BCVA(LogMAR)、CMT呈显著正相关，说明随着BCVA(LogMAR)、CMT的升高，IL-8分泌升高，提示IL-8表达与患者视力、视网膜状况有关，也可能与PCV的进展有关。Logistic回归分析显示，IL-8为PCV发生的独立危险因子。以上结果提示房水中IL-8参与PCV的发生，且其表达上调与视力、视网膜病变程度有关。

CXCR1、CXCR2基因为CXCR家族中的重要成员，均定位于染色体2q35，在单核细胞、T 淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞表面表达[15]。CXCR1和CXCR2均为 IL-8 受体，与IL-8都有高度的亲和性，IL-8与CXCR1和CXCR2结合后通过相互作用，调节下游信号通路，发挥生物学功能。CXCR1/2与IL-8结合被激活使CXCR1/2胞浆区构象改变，随后G蛋白释放二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate，GDP)结合三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)，活化效应蛋白催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)产生环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)；活化磷脂酶 C将细胞膜上磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2)水解成肌醇三磷酸(inositol-1，4，5-trisphosphate，IP3)，导致细胞内Ca2+浓度升高，激活钙调蛋白激酶，升高蛋白质磷酸化水平，使效应细胞发生迁移、脱离，分泌活性产物，进而参与机体炎症、血管形成、肿瘤迁移等生理过程。关于肠道炎症疾病的研究发现，IL-8与CXCR2相互作用，进而促使炎性细胞向肠黏膜转移和浸润，加速肠道炎症反应[16]。在肿瘤组织中，IL-8与受体CXCR1、CXCR2结合后可促使微环境中血管形成，促进细胞迁移、侵袭，从而促进肿瘤细胞的生长、转移[17]。癌细胞研究显示，上调CXCR1/2可增加癌细胞对IL-8反应性，加速疾病进展[18]。采用CXCR1/2拮抗剂G31P封闭CXCR1/2后，可降低IL-8表达水平，同时降低肿瘤细胞侵袭、转移能力[19]。研究显示，CXCR1和CXCR2可在内皮细胞表达，且在内皮细胞生长、烧伤愈合、血管生成中发挥重要作用[20]。体外移植实验显示，CXCR1和CXCR2可在受损皮肤角质层表达，且可通过调控Th1/Th2调节角质层细胞的表达[21]。然而二者是否与PCV的发生有关，目前尚未有报道。本研究发现，PCV患者房水中CXCR1和CXCR2 mRNA表达明显升高，表明房水中IL-8受体CXCR1和CXCR2的异常表达与PCV可能有关。进一步研究发现，PCV患者房水中CXCR1和CXCR2的表达水平与BCVA(LogMAR)呈正相关，与CMT呈正相关，说明随着BCVA降低、CMT的升高，CXCR1和CXCR2表达逐渐升高，提示患者视力、视网膜状况能够影响房水中CXCR1和CXCR2的表达，CXCR1和CXCR2可能与PCV的进展有关。Logistic回归分析显示，CXCR1和CXCR2为PCV发生的独立危险因子。以上结果提示房水中CXCR1和CXCR2参与PCV的发生，且与病程进展有关。此外，ROC曲线分析显示，IL-8、CXCR1、CXCR2诊断PCV的AUC分别0.882、0.860、0.812，提示PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2对PCV诊断均有一定价值，可能是PCV的潜在诊断标志物。

综上所述，PCV患者房水中IL-8、CXCR1、CXCR2表达上调可能与PCV的发生有关，有望成为PCV早期诊断及治疗的潜在靶点和诊断指标。但本研究仅从临床水平研究IL-8及其受体在PCV诊断中的临床意义，并未从分子机制上进行深入研究，有待后续进一步探究。