氢对氧化应激诱导的视网膜衰老的保护机制

李睿婵，刘 华，李丽华

•KEYWORDS:hydrogen; oxidative stress injury; DNA damage

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)又称为老年性黄斑变性，是老年人的首要致盲疾病[1]。由于ARMD会导致患者中心视力丧失，其致盲率高，因此患者的生活质量极度下降。随着全球人口老龄化日益突出，ARMD的患病率也不断上升。为此，探讨该疾病病理机制以及寻找新的治疗方法迫在眉睫。而导致ARMD的病因较多，发病机制复杂且争议较多，尽管国内外对ARMD的发病机制进行了大量的基础和临床研究，但其发病机制仍不清楚，目前尚缺乏理想的治疗方法和药物。研究表明，碘酸钠(sodium iodate，NaIO3)鼠尾静脉注射可使视网膜发生氧化应激反应，从而导致细胞重要的蛋白和DNA受到破坏[2]，是目前模拟ARMD较为理想的动物模型。氧化应激是造成ARMD的主要原因之一[3]，又有研究表明视网膜衰老也是ARMD发病的重要因素[4]，并且氧化应激通过损伤DNA使维持细胞基本生理功能的基因表达失活，从而导致细胞衰老[5]。我们之前的研究初步证实，氢(hydrogen，H2)通过减少Sirt3蛋白表达的下调并抑制衰老对氧化应激诱导的视网膜损伤起保护作用[6]。由于在衰老发生过程中，伴随活性氧(reactive oxygen species, ROS)诱导的氧化线粒体DNA损伤产生[7]，并且还有相关研究表明DNA损伤常常伴有氧化应激的产生[8]。因此，本实验通过研究氢对氧化应激诱导的视网膜损伤保护作用的机制，探讨通过降低DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)以延缓视网膜衰老对视网膜氧化应激损伤的保护作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物和分组取6～8周龄C57BL/6J正常雄性小鼠30只，体质量18～24g(购买于北京维通利华实验动物技术有限公司)。小鼠饲养于SPF级，21℃ 12h光照，12h黑暗。动物管理符合动物保护条例并符合动物伦理委员会要求。实验前通过裂隙灯检查排除眼前节疾病，按随机数字表法将小鼠随机分为三组：对照组、模型组(NaIO3处理组)和治疗组(H2水灌胃组)，每组10只。

1.1.2试剂和仪器酶标仪、凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)；恒温水浴锅(上海荣计达实验仪器公司)；ECL发光成像系统(美国Bio-Rad公司)；高速低温离心机(美国Sigma公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)。NaIO3粉末(北京索莱宝公司)，戊巴比妥钠粉末(美国Sigma公司)；H2水(北京活力氢源饮品有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；兔抗小鼠ATM单克隆抗体(英国Abcam公司)、兔抗小鼠NF-κB单克隆抗体(英国Abcam公司)、兔抗小鼠细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)单克隆抗体(英国Abcam公司)、兔抗小鼠HMGB1单克隆抗体(英国Abcam公司)，以及小鼠抗小鼠GAPDH单克隆抗体(Proteintech公司)。HRP标记山羊抗兔IgG二抗(Proteintech公司)、HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(Proteintech公司)；ECL显影液(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1建立视网膜氧化应激损伤模型用9g/L生理盐水溶解NaIO3粉末，浓度为2mg/mL，4℃保存。模型组小鼠生理盐水灌胃7d后造模，按20mg/kg剂量鼠尾静脉注射NaIO3，再行生理盐水灌胃5d；对照组小鼠注射相同剂量的9g/L生理盐水12d。治疗组NaIO3注射前小鼠予富含H2的饮用水灌胃(6mL/d)预防性治疗7d，然后与模型组一同鼠尾静脉注射NaIO3，注射后继续灌胃治疗5d。

1.2.2HE染色每组随机取3只小鼠，石蜡切片，常规HE染色，具体步骤同本课题组之前的研究[6]。

1.2.3SA-β-gal染色检测氢对小鼠视网膜衰老的影响衰老的细胞会表达一种特异性的衰老相关的β-半乳糖苷酶。这种酶特异性存在于衰老的细胞中，检测衰老相关的SA-β-gal的活性变化即成为检测衰老的重要指标[9]。每组随机取3只小鼠的右眼，40g/L多聚甲醛固定过夜，300g/L蔗糖脱水，OCT包埋后切片，切片厚8μm，将其固定在载玻片上，在5mL/L戊二醛/PBS(pH=6.0)中室温固定15min，固定后将视网膜在PBS(pH=6.0)中洗涤2次，在SA-β-gal染色溶液中浸泡37℃孵育过夜，在光学显微镜下观察。

1.2.4Western-blot检测简言之，每组剩余的4只小鼠，分别摘取小鼠双眼视网膜，视网膜组织蛋白提取物(15～20μg)通过二烷基苯磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离并转移至PVDF膜上，1% BSA封闭2h，一抗与TBS按照1∶1000的比例稀释，4℃摇床孵育过夜。TBST洗3次，每次6min，二抗与TBS按照1∶2000的比例稀释，室温下摇床孵育2h。ECL显色，暗室曝光，通过凝胶成像系统记录图像。每个实验至少重复3次，Image J 4.0软件进行蛋白质半定量分析。

2结果

2.1氢对NaIO3诱导的视网膜损伤的影响HE染色结果见图1，NaIO3可引起视网膜变薄。它不仅降低了视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)与感光细胞之间的黏附力，而且还使RPE层不连续。并且在RPE周围出现点状和大小不均匀的大量黑色沉积物。此外，光感受器内节段(inner segment，IS)和外节段(outer segment，OS)几乎无法识别。外核层(outer nuclear layer，ONL)中的细胞数量下降，该层的线性结构消失并且有半玫瑰花结构和内陷的形成，在用H2治疗的小鼠中防止了这种损失。同样，NaIO3小鼠内核层(inner nuclear layer，INL)中的细胞密度降低。我们发现H2不仅可以减少布鲁赫膜中NaIO3诱导的黑色沉积物的数量和大小，还可以减少视网膜变薄。此外，H2防止了ONL和INL细胞密度的降低和无序排列。

2.2氢对小鼠视网膜衰老的影响SA-β-gal染色结果见图2，在光学显微镜下观察，衰老形态的细胞SA-β-gal染色呈蓝绿色。对照组着染阴性，仅有个别着染蓝绿色的细胞；模型组SA-β-gal着染蓝绿色的细胞较对照组显著增加，表明伴随NaIO3诱导的氧化应激的增加，视网膜细胞的衰老也增多；而治疗组SA-β-gal着染蓝绿色的细胞与模型组相比显著减少。由此推断，H2可以抑制视网膜衰老，对视网膜细胞起保护作用。

2.3氢对氧化应激诱导的视网膜中DNA损伤反应相关蛋白表达的影响Western-blot检测结果显示(图3)，模型组中DNA损伤反应相关蛋白的相对表达量(ATM 0.77±0.08，NF-κB 0.70±0.02，Cyclin D1 0.36±0.01)较对照组(ATM 0.17±0.012，NF-κB 0.27±0.02，Cyclin D1 0.07±0.002)显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)，说明氧化应激的产生诱导了DNA损伤。而治疗组中DNA损伤反应相关蛋白的相对表达量(ATM 0.10±0.009，NF-κB 0.32±0.01，Cyclin D1 0.19±0.002)较模型组显著降低，差异均有统计学意义(t=708.7、142.6、105.3，均P<0.01)，表明H2能够降低氧化应激诱导的视网膜DNA损伤。

图1小鼠视网膜HE染色A：对照组；B：模型组；C：治疗组(图中黄色箭头指示为黑色玻璃膜疣沉积物)。

图2小鼠视网膜SA-β-gal染色A：对照组；B：模型组；C：治疗组。

图3氢对氧化应激诱导的视网膜中DNA损伤反应相关蛋白表达的影响A：DNA损伤反应相关蛋白表达水平；B：各组ATM、NF-κB、Cyclin D1蛋白相对表达量比较。aP<0.05，bP<0.01vs治疗组。

图4氢对氧化应激诱导的视网膜中DNA损伤修复相关蛋白表达的影响A：DNA修复蛋白HMGB1表达水平；B：各组HMGB1蛋白相对表达量比较。bP<0.01vs模型组。

2.4氢对氧化应激诱导的视网膜中DNA损伤修复相关蛋白表达的影响Western-blot检测结果显示(图4)，三组HMGB1蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义(F=82.66，P<0.01)。且模型组中HMGB1蛋白的相对表达量(0.383±0.07)较对照组(1.232±0.03)明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；而治疗组中HMGB1蛋白的相对表达量(0.927±0.06)较模型组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。说明氢可以促进视网膜DNA损伤修复。

3讨论

ARMD是黄斑区的退行性病变，可使中心视力进行性、不可逆性丧失，严重威胁着老年人的视力，是发达国家中老年人视力不可逆下降的主要原因[10]。近年来，我国社会人口老龄化不断加剧，ARMD 的发病率有逐年增高的趋势[11]。随着我国人民生活水平的提高，人均寿命的延长，人们对生活质量越来越重视，影响人视觉健康的眼病日益受到全社会的关注。尽管黄斑变性是多因素导致的眼底部疾病，但据报道，年龄是ARMD最主要的危险因素，高龄ARMD患者的死亡率增加[12]。视网膜衰老是ARMD发病的重要因素，因此，如能减缓视网膜的衰老就可以从源头上减少ARMD发病率，并减慢其病程进展[13]。而细胞的氧化损伤在衰老过程中起着重要作用[14]。氧化应激是衰老的促进因素[15]。在衰老和衰老相关疾病中可以发现过多的ROS及其他氧化应激产物[5]，因此降低ROS水平已成为鉴定是否有效抗衰老的一个标准[16]。由于目前没有药物可以完全模拟临床ARMD疾病，NaIO3是一种稳定的氧化剂，诱导的视网膜损伤目前被认为是ARMD研究的理想动物模型。本实验延用我们之前的实验动物模型[6]，通过HE染色发现NaIO3造模后，可使视网膜变薄，降低了RPE层与感光细胞之间的黏附力并且使RPE层不连续；在布鲁赫膜中出现点状和大小不均匀的大量黑色沉积物。此外， INL层和ONL层细胞数量下降，线性结构消失。且我们之前的研究已经表明，氢能够减少氧化应激诱导的视网膜衰老相关蛋白P53、P21和P16蛋白表达[6]。本研究中利用衰老特异性SA-β-gal染色，可见给予H2后显著减少了视网膜中蓝绿色沉淀，这进一步验证了我们之前的研究。

由于高能量需求及光暴露，视网膜对氧化应激高度敏感[3]，过量的ROS可以损害视网膜脂质、蛋白质和DNA，随后导致视网膜细胞死亡[2]。衰老可以由DNA损伤有关的各种刺激引发[17]，并且DDR的激活证明发生了细胞衰老[18]。DNA损伤会激活ATM[19]，本实验结果显示，治疗组ATM的表达量明显低于模型组。还有研究表明，Cyclin D1过表达增强了DDR，相反Cyclin D1减少则降低了DDR，并且Cyclin D1蛋白表达升高会伴随P21蛋白的上调，进而促进了DDR[20]，所以我们进一步检测了Cyclin D1的表达，结果显示治疗组中Cyclin D1表达量较模型组明显降低。此外，DDR下游的参与者中有NF-κB，其可以被DNA损伤激活，反过来NF-κB活化又会导致DNA损伤增加[21]，数据显示ATM也可以激活NF-κB[22-23]，故我们还检测了NF-κB的表达，发现治疗组中NF-κB表达量较模型组明显降低。最后，有报道称高迁移率族蛋白HMGB1有DNA修复功能[24]，可以挽救DNA损伤，延长寿命[25]，所以本研究进一步探讨其是否也有这种作用，结果显示治疗组中HMGB1表达量较模型组显著上调。综上说明氢通过降低DDR、促进DNA的修复，进而对视网膜氧化应激损伤起保护作用。保护线粒体DNA免受氧化应激损伤将是延缓ARMD进展的一种新策略[26]。

我们的研究为治疗ARMD提供了新思路，但对ARMD病理机制和治疗还需继续深入开展，进一步探索ARMD发病机制，并开发ARMD治疗药物仍是研究工作者关注的热点。