MicroRNA在针灸研究中的应用与进展

宋立新,陈采陶,陈艳焦,张雪,尹磊淼,2,王宇,2,杨永清,2,徐玉东,2

(1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030)

针灸治疗疾病在中国已有上千年的历史,自20世纪70年代早期开始,由于针刺镇痛的显著疗效及应用,针灸引起了全球广泛关注,被越来越多的国家所使用,同时针灸作用机理的研究在世界范围内陆续开展,采用了诸如神经示踪、红外线摄影、核磁共振成像、生物化学分析等现代科学技术探索传统针灸疗法的科学内涵,并提出了各种假说。然而,关于针灸疗法的若干科学问题,比如针灸的分子作用网络和作用机制,以及关键的调控靶标还不清楚,有待进一步的系统研究。

针灸效应是一种生命现象,生命活动是建立在蛋白质及其相互作用基础上的信息传导过程,这个过程是基因表达、蛋白质功能、蛋白质相互作用的信息反映序列[1]。系统生物学为研究基因、蛋白、代谢产物之间复杂的关系,阐明针灸整体性调控网络提供了技术和方法。系统生物学的主要技术平台为组学,包括基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学等,其中基因组学和蛋白质组学是较早出现并较为成熟的组学技术,能有效筛选出针灸效应的潜在靶点,这为探求针灸效应机制提供了有效信息。例如,国内研究团队利用基因表达序列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)对针刺治疗哮喘大鼠的肺组织基因组表达谱进行了研究,发现针刺抗哮喘特异性差异表达基因21个[2];蛋白质组研究发现28种针刺抗哮喘相关效应蛋白[3]。通过对这些调控基因和蛋白的生物功能和相互作用分析初步阐明了针刺抗哮喘的分子调控网络,并为基于针刺效应物质基础的哮喘防治靶标研究提供了新的思路[4]。另一方面,大量的基因组序列数据证实,DNA上编码蛋白质的区域只占人类基因组的极小部分(不足2%)[5-6],其余均是非编码序列。转录组的实验结果表明,这些非编码序列是可以表达的,其表达产物为非编码 RNA(non-coding RNA)。越来越多的研究证明非编码 RNA具有重要的生物学功能,其中microRNA就是一类发挥功能性调节作用的短链非编码 RNA[7]。将 microRNA引入针灸作用机制研究领域,可在基因转录及其他层面更系统深刻地揭示针灸作用的分子调控网络。本文就microRNA及其靶基因分析在针灸作用机制研究中的应用和进展进行综述,现报道如下。

1 MicroRNA的产生及生物学特性

MicroRNA是由19～25个核苷酸组成的非编码单链小分子 RNA,广泛存在于除真菌和海洋植物以外的所有真核细胞中[8]。MicroRNA起初在胞质中由RNA聚合酶Ⅱ的作用下从 DNA转录一个原始的内源性初级microRNA(Pri-miRNA),Pri-miRNA在核内被核酸酶Drosha和辅助因子Pasha加工处理成70个核苷酸组成的具有茎环结构的前体microRNA(Pre-miRNA)[9];在转运蛋白exportin-5的作用下Pre-miRNA由核内转到胞质,再由另一种核酸酶Dicer将其剪切成19～25个核苷酸的双链成熟microRNA,成熟双链microRNA的一条链与Argonaute蛋白等组装形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),RISC特异性识别特定mRNA的3'非翻译区(3'untranslated regions, 3’UTR)并与之不完全互补配对,从而抑制翻译或直接降解靶mRNA的表达,广泛参与调控细胞分化、增殖、凋亡等生理及病理过程。

随着研究深入,发现microRNA具有以下生物学特性,microRNA不仅在其自身进化上具有高度的保守性,在不同物种间靶位点也具有保守性;另外,microRNA-mRNA构成的双链具有热稳定性;MicroRNA沉默靶基因的形式由microRNA与其靶基因的互补程度决定,如果完全互补配对则使靶 mRNA被降解(在植物中比较常见),如果不完全互补则在蛋白质翻译水平上抑制靶基因表达(常见于哺乳动物);最近研究发现,microRNA的作用位点可能是 3’UTR之外的其他位点,例如5’UTR、启动子区或者是 mRNA的编码区;每个microRNA可以有多个靶基因,而不同的microRNA也可以调节同一个靶基因。基于以上多种方式的调控作用microRNA构建了一个由点到网状的复杂的调控网络,既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个 microRNA的组合来精细调控某个基因的表达,microRNA的网络调控特点与针灸多途径、多靶点、多水平、多层次等调节作用特点高度契合。目前越来越多的研究从 microRNA及其调控靶基因的角度探索针灸治疗疾病的效应机制,并取得了丰富的研究成果。

2 MicroRNA在针灸机制研究中的应用

2.1 神经系统疾病中的研究

MicroRNA在中枢神经系统含量丰富,参与调控神经系统的生长、发育,同时也参与神经系统重大疾病的发生发展,如脑缺血性再灌注引起的中风后遗症、神经系统肿瘤、损伤等疾病[10]。研究表明大鼠动脉闭塞引起的脑缺血能够改变多种microRNA的表达,它们参与调控一些神经元保护受体功能及炎症细胞因子,可以调节脑卒中的病理生理学过程[11]。研究发现针刺百会、风府、大椎穴预处理后,脑缺血再灌注模型大鼠局灶性脑梗死后大脑皮质miR-290、miR-494表达量显著降低,水通道蛋白-4(Aquaporin-4, AQP4)表达明显升高,提示通督调神针灸预处理可能通过提高 miR-290、miR-494表达降低AQP4相对表达量,诱导脑缺血耐受,减轻脑水肿而预防脑梗死引起的脑损伤[12]。电针刺激天门、百会、大椎穴能有效降低脑缺血大鼠的神经行为学评分和脑水含量,并通过调控 miR-664来降低MMP9相对表达量,增强脑缺血耐受减轻脑水肿,这可能是针灸预处理的脑保护机制之一[13]。另外,针刺大鼠百会、足三里能下调脑缺血大鼠脑组织及血清miR-29、上调miR-320表达,减轻大鼠缺血再灌注后脑损伤[14],针刺后还可下调脑缺血再灌注脑损伤大鼠外周血miR-126和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达促进脑缺血性脑损伤后血管再生,有助于脑组织损伤后再修复[15]。在另一项研究中,电针能够调节miR-134表达,miR-134通过调控LIM激酶(LIM kianse 1, LIMK1)参与电针改善缺血性脑卒中恢复阶段海马突触的可塑性,在脑卒中恢复阶段是促进学习和记忆的重要因素之一[16]。

电针曲池和足三里治疗大脑中动脉闭塞模型大鼠,能够缓解神经功能缺损症状并减少大脑梗死面积,且电针后梗死灶周围大脑皮层组织中 miR-9的表达升高,NF-κB 信号通路相关的因子(NF-κB p65、TNF-α、IL-11β等)表达水平下调,进一步研究发现给予 miR-9抑制剂,电针对大脑炎症的缓解效应及对 NF-κB信号通路下游的信号分子的抑制作用显著降低,但 miR-9抑制剂对NF-κB信号通路上游信号分子水平无明显影响,提示电针可能通过 miR-9调控的 NF-κB信号通路下游信号分子发挥大脑皮层保护作用[17-18]。电针治疗中风调节相关microRNA和蛋白对轴突再生有益,在电针对脑缺血性中风的靶向研究中发现电针治疗 28 d内免疫球蛋白样受体B(Paired immunoglobulin-like receptor, PirB)mRNA表达减少,促进了损伤后的神经突触的生长,另外用荧光素酶报告分析证实 miR-181b可直接靶向 PirB mRNA以调节 PirB、RhoA和 GAP43的表达来改善神经功能,促进损伤的修复,说明电针通过调节miR-181b调控靶基因PirB发挥修复神经损伤效应,这可能是电针治疗中风促进康复的一种新机制[19]。在针灸治疗脑缺血再灌注损伤的效应机制研究中发现针刺百会、足三里可上调 miR-124、下调整合素β1蛋白的表达,这些变化可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤[20]。

电针已被证明有助于神经功能和脊髓损伤(SCI)的恢复,可促进脊髓损伤后的功能恢复并具有抗细胞凋亡作用,有研究发现电针治疗调控了 SCI大鼠的脊髓组织中 43种 microRNA表达,其中通过下调 miR-181a调控MAPK磷酸酶-5(MKP-5)发挥抗细胞凋亡作用,电针的神经保护作用部分是通过调节 SCI大鼠的miR-181a抑制p38 MAPK活化来调节的[21]。在另一项针对SCI的研究中,电针处理miR-214表达显著上调,进一步验证发现细胞凋亡相关蛋白Bax和疼痛相关蛋白Nav1.3是miR-214体外和体内的两个功能靶点,电针治疗后miR-214表达上调抑制了SCI诱导的Nav1.3和Bax的表达从而降低了神经功能和脊髓的损伤程度,这表明miR-214在电针治疗SCI功能中发挥了重要的靶点效应[22]。在电针治疗SCI的机制研究中,研究者对T10段脊髓损伤大鼠模型进行电针干预,发现治疗后 T10段脊髓中miR-449a的表达显著降低。与模型组相比,电针同时显著降低了caspase3、TNF-α、IL-1β表达水平和 Bax/Bcl-2比值(P＜0.01),而明显上调 Nestin、NeuN和CGRP表达(P＜0.05或P＜0.01),荧光素酶报告基因检测显示miR-449a与CGRP的3'UTR结合,从而调控 CGRP的表达,研究结果表明电针通过下调 miR-449a表达促进神经干细胞的增殖和神经元的存活,加快了脊髓损伤的恢复[23]。

2.2 消化系统疾病中的研究

针灸作为一种传统疗法治疗消化系统中胃肠疾病疗效早已得到临床证实[24-25],在机制方面的研究也提示针灸治疗是多水平、多靶点的。利用针灸治疗术后肠梗阻(postoperative ileus, POI)的研究发现,在结直肠切除术和结肠吻合术后小鼠模型中检测出 IL-6和miR-19a在Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal, ICC)中的表达量增加,ICCs中KIT和ano1在小鼠结肠切口周围表达下降。针刺治疗可显著降低炎症细胞因子IL-6水平以及miR-19a的表达,抑制巨噬细胞的活化,同时促进ICCs中KIT和ano1的恢复。在结直肠切除术后患者血清中高表达的miR-19a也可通过针灸干预使其表达量降低从而抑制炎症反应[26]。慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)模型大鼠针刺中脘、足三里、脾俞穴治疗后胃黏膜损伤的修复程度明显优于对照组和模型组,实验结果还显示 CAG大鼠胃组织中NF-κBp65、miR-155、miR-21上调,miR-146a的表达下调,并且CAG大鼠中miR-146a和 miR-155/miR-21之间呈负相关。针刺治疗后 NF-κBp65、miR-155和 miR-21的表达下调,miR-146a表达上调,说明 NF-κBp65、miR-155、miR-21 和 miR-146a可能在针刺治疗CAG的过程中发挥重要作用[27]。

2.3 免疫系统疾病中的研究

研究证实 microRNA对免疫系统细胞的发育分化[28-29]、炎症细胞因子的产生[30]有重要调节作用。电针足三里治疗 2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)诱导的接触性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)大鼠模型后,获得治疗组和模型组大鼠腹膜肥大细胞(rat peritoneal mast cell, RPMC)并在 IL-33刺激下培养,结果发现与模型组相比电针治疗组的ACD大鼠RPMCs在IL-33刺激后,IL-6、TNF-α、IL-13和 MCP-1表达量显著下调,并降低了 RPMCs中miR-155的表达,同时抑制了NF-κB和AP-1活化;进一步将miR-155模拟物转染到RPMCs中使其过表达,与未转染miR-155的RPMCs相比炎症细胞因子明显增加,表明电针对DNFB诱导的ACD大鼠可通过调控miR-155表达发挥抗炎作用[31]。大量的研究发现针灸对免疫系统疾病具有显著的调节作用,但是microRNA在针灸调节免疫系统效应机制中的研究还很欠缺,需要进一步加大研究力度。

2.4 循环系统疾病中的研究

有研究者运用基因芯片技术研究电针内关穴对心肌缺血再灌注损伤的保护机制,发现电针治疗可逆转模型中的基因差异表达,其中多个基因参与了氧化应激、心肌收缩、血管平滑肌收缩、肥大细胞受体、NOD样受体等生物学途径,这提示了针刺调节基因表达参与了循环系统的生物学调控效应[32]。研究发现电针刺激穴位配伍组(关元、足三里)可以有效预防和治疗心肌缺血,治疗后血清中肌酸激酶-MB(CK-MB)、血管细胞黏附分子(VCAM-1)和内皮素-1(ET-1)均显著升高(均P＜0.01),细胞凋亡指数显著增加(均P＜0.01)。和其他组别相比,穴位配伍组显著上调了 miR-133并且抑制了miR-208、miR-1和miR-499的表达,其保护心肌的作用可能与增加 miR-133和抑制 miR-208、miR-1和 miR-499表达的双重调节有关[33]。研究发现许多microRNA和蛋白质参与了针刺对高血压大鼠疗效反应,针刺后miR-339和Sirtuin2(Sirt2)的表达发生变化[34-35],在人类 SH-SY5Y细胞中过表达 miR-339则Sirt2表达下调,而敲低miR-339后人SH-SY5Y细胞和大鼠PC12细胞中Sirt2的表达上调;另外miR-339过表达增加了SHSY5Y细胞中NF-κB和FOXO1的乙酰化,进而推测针刺可能通过表观遗传修饰和随后对其靶标(如 miR-339/Sirt2/NF-κB/FOXO1 轴)调控发挥效应[36]。针刺太冲穴治疗自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)后髓质的microRNA表达发生变化,针刺组与 SHR模型组相比差异表达的microRNA有23种。与正常对照大鼠相比SHR模型中miR-339、miR-223和miR-145在脑髓质中表达下调,在针刺太冲穴后SHR中miR-339、miR-223和miR-145上调至基线水平,表明针刺太冲穴治疗的SHRs可调节microRNA的变化参与调控大鼠血压反应[34]。

2.5 运动系统疾病中的研究

针刺可以治疗慢性肌损伤、膝关节炎等运动系统相关疾病。有研究发现电针曲池、足三里穴可以促进大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠神经干细胞增殖分化,改善 MCAO大鼠受损的神经运动功能[37-38]。进一步研究发现电针曲池、足三里穴可通过激活miR-146抑制Notch1的表达,促进缺血侧成熟神经元分化,从而改善脑缺血性再灌注损伤后神经元功能,促进脑卒中后肢体运动功能恢复[39]。低频电刺激(low-frequency electrical stimulation,LFES)预防肌肉萎缩的效应和机制研究中,对5/6肾切除小鼠(CKD小鼠)进行15 d的LFES治疗,发现LFES可以防止CKD小鼠比目鱼肌和指长伸肌的重量减少和后肢肌肉抓力的丧失。进一步研究发现 miR-1和miR-206的表达在LEFS后的急性反应期明显降低,而miR-1和miR-206可靶向抑制IGF-1蛋白的翻译表达,说明LFES可能通过抑制miR-1和miR-206表达激活IGF-1信号通路,促进蛋白合成、肌生成以及肌肉蛋白代谢,改善CKD诱导的骨骼肌萎缩[40]。

2.6 其他疾病

蒙医温针灸治疗失眠的研究中发现,接受温针灸治疗(百会穴、大椎穴、心俞穴)的大鼠与正常大鼠相比有 141个差异表达的 microRNA,其中针灸后 miR-101a表达明显上调,转染miR-101a模拟物后大鼠海马细胞中miR-101a的表达水平升高,而大鼠神经元细胞中PAX8蛋白的表达受到明显抑制,同时下丘脑、海马和前额叶皮质中IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α水平显著降低,说明温针灸治疗的失眠大鼠与上调 miR-101a水平进而抑制PAX8的表达直接相关[41]。在研究抑郁症(chronic unpredictable mild stress, CUMS)大鼠在电针干预下microRNA的表达变化中发现,电针不仅显著改善了CUMS大鼠的交配数量、蔗糖偏好、体重等行为学指标,而且芯片分析显示 CUMS大鼠中高表达的miR-383-5p和miR-764-5p在电针干预后表达下降,生物信息学分析发现miR-383-5p和miR-764-5p靶基因相关的20个信号通路和21个GO功能和抑郁症相关,miR-383-5p和miR-764-5p的变化表明电针可能通过调控相关 microRNA促进神经营养因子和抑郁神经元的异常凋亡,作用于其相关通路来发挥抗抑郁效应[42]。最新的研究表明电针可能通过下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)缓解术后下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的功能亢进,该研究利用生物信息学分析证实microRNAs对CRH具有靶向调控作用,并在初级下丘脑神经元中筛选鉴定出miR-142和miR-376c在mRNA和蛋白水平上抑制 CRH,通过双荧光素酶报告基因检测证实它们与CRH的3’UTR结合。进一步分析发现,在肝切除术大鼠中,下丘脑miR-142表达降低,电针干预后,miR-142和miR-376c表达升高。重要的是,电针对肝切除术大鼠HPA轴调节功能的改善作用被miR-142拮抗剂阻断,证明电针可以上调下丘脑 miR-142的表达,降低CRH水平,以减轻肝切除术引起的HPA轴过度激活[43]。

3 讨论

针灸刺激对机体生理、病理过程的影响存在多系统、多脏器、多靶点的整体综合性作用特点,在体内引起的反应包括调节基因、蛋白、代谢等多个层面。系统生物学为研究分子、细胞、器官和个体等各水平间的复杂相互作用提供了技术手段,使针灸作用机制研究从单个或几个分子基因或蛋白的研究模式,转向分析“组学”变化的整体水平研究模式,加速了对针灸效应这一复杂生命现象的理解。诸多研究表明microRNA通过调控靶基因表达影响相关信号通路,在不同的生物学过程中发挥重要生物学作用,是基因表达调控网络中关键的一员,也是一类很有前景的新的生物学标志物。MicroRNA在针灸研究中的应用为解释针灸刺激与机体基因、蛋白组学的变化之间架起一座桥梁,这在针灸效应机制的研究中具有重要的价值。近年来,国内外学者主要对针灸治疗神经系统疾病的microRNA调节机制开展了大量研究工作,同时也对针灸治疗失眠、高血压、接触性皮炎等疾病 microRNA表达谱进行了分析,发现针灸能够调控多个 microRNA的表达水平,并通过生物信息学分析预测相关靶基因和调控网络。MiR-124、miR -101a、miR -339、miR-214等若干与针灸作用相关 microRNA及其靶向基因的逐步发现,为疾病的治疗提供了新的可能干预靶标,也为基于针灸效应机制研究创新疾病防治策略提供了新的思路。

尽管近年来已初步明确了一些针灸效应的microRNA作用机制,但同时也发现microRNA这一研究方法应用于针灸基础研究还有待进一步加强和拓展。基于针灸的一些基础科学问题,比如经穴特异性、穴位敏化研究、艾灸产生作用的机制和规律,以及一些针灸临床优势病种比如镇痛、过敏性疾病中通过microRNA表达调控的研究等,从转录调控层面进一步认识针灸的作用规律和物质基础尤为必要。另一方面,在发现新的针灸调控 microRNA的基础上还要结合基因表达谱分析深入开展microRNA与靶基因表达相关性、功能恢复实验研究等,明确针灸作用的分子机制。MicroRNA研究技术和方法也在不断发展和完善,基于 microRNA的信息寻找 lncRNA及 mRNA对应的关系,构建 ceRNA调控网络;MicroRNA靶向负调控基因之外的非经典分子途径研究;对多条microRNA共同调控靶基因和信号通路,或以microRNA簇为单位的研究;MicroRNA的甲基化及microRNA转运和定位分析等为microRNA研究提供了新的切入点。将上述新的microRNA研究方法和策略应用于针灸机制研究将从全新的角度解释针灸刺激如何构建基因表达调控网络,有助于从更深层面上挖掘针灸效应调控机制并发现治疗新靶点。