新生抗原在肿瘤免疫治疗中的应用进展

2019-02-12李建民李常颖

实用医学杂志 2019年19期

李建民李常颖

天津医科大学第二医院，天津市泌尿外科基础医学重点实验室（天津300211）

肿瘤细胞在基因变异的基础上产生的带有特异性氨基酸序列蛋白被称为“新生抗原（neoantigen）”。只有发生突变进而导致氨基酸序列的改变，才会使这些蛋白产生抗原性。如果发生序列改变，这些蛋白会引起自身免疫系统的警惕，进而引起一系列免疫应答。因此，这些可作用于免疫系统，由肿瘤细胞基因突变产生的异常蛋白，即称为新生抗原。针对肿瘤治疗而言，从手术切除、化疗、放疗到如今的靶向治疗，治疗手段层出不穷。近年来，肿瘤免疫治疗在个体化肿瘤治疗中的潜在优势引起广泛的关注。有研究者预测，所有的肿瘤都有一定数量的新生抗原，这一数量与基因突变的数量呈正相关。新生抗原在肿瘤免疫治疗领域中所具有的价值正受到越来越多的关注。本文即对新生抗原及其在肿瘤免疫治疗中的作用进行综述。

1 新生抗原——开启肿瘤免疫治疗的新篇章

人体免疫系统具有免疫检测功能，能够有效识别体内产生的肿瘤细胞并将其清除。同时，通过激活机体特异性的免疫应答，抑制肿瘤的发生和发展。部分肿瘤细胞往往能够通过多种机制逃避免疫系统的识别和清除，幸存下来并在机体内继续增殖，最终导致肿瘤的发生。

肿瘤免疫治疗即通过重启机体自身的免疫识别功能，增强机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而有效控制肿瘤生长，进而清除肿瘤的一种治疗方法。一般来说，肿瘤免疫治疗分为被动免疫疗法和主动免疫疗法，主要包括基于单克隆抗体药物的治疗性抗体，特异性单克隆抗体类免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor）、小分子抑制剂、免疫系统调节剂、癌症疫苗和免疫细胞疗法等。迄今为止，FDA 已经批准多个肿瘤免疫治疗的药物应用于肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等病症的治疗研究，临床效果表现良好。随着基于治疗性单克隆抗体药物的被动免疫疗法在临床中的大量开展，一些耐药性、过敏反应以及预后的癌症高复发率引起的副作用逐渐被研究者发现，使得科学家们不得不进一步寻求新的治疗手段。因此，基于肿瘤疫苗的主动免疫疗法被认为是一个有潜力的替代疗法而被人们所熟知。肿瘤疫苗的设计原理是将肿瘤抗原以多种形式如：肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因等，导入患者体内，抵抗肿瘤引起的免疫抑制状态，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的目的。

设计肿瘤疫苗的最关键步骤是要找到正确的抗原。肿瘤抗原在传统上分为两大类。一类是“肿瘤相关抗原”（tumor associated antigen）；一类是“肿瘤特异性抗原”（tumor specific antigen，TSA）［1］。“肿瘤相关抗原”是一类同时表达在肿瘤细胞和正常细胞表面的抗原。由于生长的需要，肿瘤细胞可能会在其表面过度表达某些抗原，这种表达水平的差异就给了患者一定的“治疗空间”。因此通过识别并攻击这类抗原也可以达到“多杀敌，少伤己”的效果。而“肿瘤特异性抗原”顾名思义是正常细胞不存在的，肿瘤细胞特有的一些抗原，通过免疫应答可以准确地杀伤肿瘤微环境中的肿瘤细胞而不会产生误伤正常细胞的副作用。因此，这类抗原应该是肿瘤免疫治疗最理想的靶点。

癌细胞在快速生长和增殖过程中，往往因为来不及修复DNA 在复制过程中出现的错误而出现新的突变蛋白，这种带有特异性氨基酸序列变异的多肽序列被称为“新生抗原”。新生抗原，是一种位于恶性肿瘤细胞表面主要组织相容性复合物的抗原表位肽。不同于人类正常细胞表面的主要组织相容性抗原（human leukocyte antigen，HLA），这些新生抗原是癌细胞特有的，具有肿瘤特异性，可以被T 细胞识别并引发免疫应答。基于大多数肿瘤患者的临床数据分析显示，内源性T 细胞能够有效识别恶性肿瘤细胞表面的特异性抗原。依据肿瘤特异性抗原的产生来源，可以将其分为两类。第一类是由非变异氨基酸组成的蛋白质或多肽序列，这些蛋白质或者多肽往往是T细胞不耐受的，第二类是在基因突变的基础上产生的带有特异性氨基酸序列变异的蛋白或多肽序列，它对于正常组织的基因组来说是不存在的，因而会引起自身免疫细胞的识别，并引起一系列的免疫应答反应。所以，在大部分肿瘤患者中，这些新生抗原表位主要是由DNA 突变形成新的蛋白质或多肽序列所导致。因此，基于“新生抗原”的肿瘤疫苗是一种真正意义上的个体化疫苗，也是目前最有可能治愈癌症的疗法，是肿瘤精准免疫治疗研究的一个重要方向。

2 肿瘤新生抗原的精准预测与筛选

新生抗原在肿瘤治疗领域具有巨大价值，因此，其精准预测及筛选则显得尤为重要。由于新生抗原主要源于肿瘤细胞自身的基因突变，鉴于基因突变的随机性及特异性以及不同患者的肿瘤细胞突变情况的差异，由此产生的新生抗原也不一样，主要由患者自身的DNA 决定的。为了筛选得到由DNA 突变诱导产生的特定性新生抗原，需要了解不同肿瘤患者的个体基因组。常用方法是采用DNA 深度测序技术，通过对患者肿瘤基因组编码的蛋白序列识别从而找到相应的突变位点，进一步预测潜在的新生抗原。随着新一代测序（next-generation sequencing，NGS）和生物信息学的发展，常用的新抗原鉴定筛选方法可分为三种不同的方法。

（1）通过WES（whole-exome sequencing）来识别肿瘤的特异性突变，并通过RNA 测序加以确认，然后基于预测的HLA 的亲和力强度高低对其进行分类，最后基于优先突变的等位基因合成新生多肽，然后离体进行T 细胞反应性分析以确认其的免疫原性。具体来说，设计成熟的基于新生多肽抗原疫苗的个性化免疫疗法的第一步是识别肿瘤的特异性突变。与免疫识别相关的突变主要包括具有外显子、插入和缺失非同义单核苷酸变体nsSNV（non-synonymous single nucleotide variants）和融合基因［2］。匹配的肿瘤细胞和正常细胞DNA的全外显子组测序WES 代表了识别体细胞基因突变的最常用方法［3］。通过RNA 测序对所鉴定的突变等位基因的表达水平进行正交验证和分析［4］。然后根据预测的与HLAⅠ型和Ⅱ型的高亲和能力对突变进行分级。免疫表位数据库和分析资源IEDB（immune epitope database and analysis resource）是一个在线综合数据库，由T 细胞表位和可用于预测MHC 结合亲和力的工具组成。IEDB提供的预测工具包括ANN（人工神经网络）∕NetMHC［5］、NetMHCpan［6］、SMM［7］、SMMPMBEC［8］、ARB和Consensus。最终还要使用T 细胞反应性分析来验证合成的新生多肽的免疫原性，即通过产生抗原负载的抗原呈递细胞来刺激T 细胞。然后必须检测CD4+和CD8+T 细胞的活化标记物，包括离体的OX-40、4-1BB、CD170a和IFN-γ［9］。OTT等［10］利用这种策略得到了由四组合成的长肽构建的个体化疫苗，基于RNA 的多表位在高风险黑素瘤患者中诱导强烈的多功能CD4+和CD8+T 细胞应答。

（2）基于WES 识别的肿瘤特异性突变，合成TMG 构建体作为产生IVT RNA 的模板，然后离体进行T 细胞反应性分析以确认其免疫原性。具体的步骤如下所示：对第一种方法进行简化，在nsSNV 的挖掘之后，串联合成多个编码突变的小基因以产生TMG（串联小基因）构建体。TMG 构建体由可变数量的遗传融合在一起的小基因组成，每个小基因编码侧翼为来自内源蛋白质序列的12 个氨基酸残基的突变。编码TMG 构建体的质粒用作模板以产生IVT（体外转录的）RNA。TRAN 等［11-12］从转移性胆管癌患者中鉴定出ERBB2IP（erbb2 相互作用蛋白）突变。在过继转移含有约25%突变特异性T 细胞的TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）后，患者肿瘤消退。随后研究中，相继证明来自10 个转移性胃肠癌患者中的9 个的新表位可被自体TIL 识别。

（3）在没有样本采集的情况下基于数据库和文献识别新表位。这一战略的关键是存在于实体瘤中发现的高频突变位点。基于这种模式，SCHUMACHER 等［13］确定了弥漫性Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤患者中最常见的突变IDH1（R132H）。然后这些作者合成了一种靶向突变体IDH1 的肽疫苗，其功能是在小鼠中诱导抗肿瘤反应。同样，OCHS 等［14］发现K27M-突变体组蛋白-3 作为产生神经胶质瘤疫苗的最佳靶标，证明靶向K27M-突变体组蛋白-3 的肽疫苗在MHC-人源化小鼠模型中引发突变特异性免疫应答。

除采用DNA 深度测序技术之外，目前还有一些其他方法也被用来筛选肿瘤新生抗原，如基于外周血单核细胞或肿瘤过滤淋巴细胞功能分析的新生抗原反应性T 细胞鉴定。它在识别已有的新生抗原反应性T 细胞的分析可能无法检测到休眠的新生抗原，尽管这些新生抗原不会引发自然发生的免疫反应，但可能是重要的治疗靶点。许多方法已被用于不同的癌症疫苗的制备，如整个肿瘤细胞裂解液、核苷酸（mRNA∕DNA）、蛋白质或肽基疫苗、树突状细胞（DC）疫苗、病毒载体以及生物材料辅助疫苗。在以新抗原为基础的癌症疫苗中，通常使用mRNA∕DNA 或合成长肽。

3 新生抗原在肿瘤免疫治疗中的应用价值

3.1 新生抗原疫苗具有抗肿瘤效果新生抗原由于其在免疫中扮演得角色，使其在肿瘤治疗领域可能发挥巨大的作用。MANDELBOI 等［15-16］纯化了一种衍生自与Lewis 肺癌细胞表面上的小鼠HLA 分子结合的突变跨膜蛋白（Connexin 37）的多肽序列。该研究表明，用代表突变的Connexin 37的合成肽进行免疫可诱导抗肿瘤CTLs 应答并保护小鼠免受自发性肿瘤转移并减少转移负荷。一系列开创性的小鼠和人类研究表明，具有错义突变的多种其他基因产物可编码同源细胞毒性T 淋巴细胞CTLs 识别的肽［17-22］。

LENNERZ 等［23］发现抗突变抗原的CTL 可以控制转移性黑色素瘤。多个时间点的T 细胞反应的临床分析表明，最主要和持久的反应靶向具有错义突变新抗原的蛋白，并且针对过表达和选择性表达的自身抗原的反应性较弱。通过框外插入或缺失，可以在某些肿瘤中产生长而全新的氨基酸序列，并且可以被T 细胞识别［24-25］。与此同时，HUANG 等［26］发现黑色素瘤细胞中的移码突变是过继转移的肿瘤浸润性T 细胞克隆的主要靶标。这些研究表明，由移码突变产生的新颖的开放阅读框架（neoORF：novel open reading frames）可以诱导高度特异性的抗肿瘤免疫，因此作为疫苗抗原非常有价值。

CARRENO 等［27］率先开始使用新抗原疫苗进行临床试验。该研究对3 例患有晚期黑色素瘤的患者预先使用了ipilimumab 单克隆抗体药物，静脉接种了了MHC I 类限制的含有8～10 个氨基酸残基的新生抗原肽疫苗和树突状细胞DCs 的混合物。临床试验结果表明，癌症疫苗新表位的作用是增加肿瘤特异性T 细胞反应的广度和多样性。

强免疫原性突变表位在癌症免疫控制中具有重要价值。研究［28-29］显示，在荷瘤小鼠体内被CD8+T 细胞识别的显性表位是在单个高表达基因中的错义的新抗原以及在转基因诱导型肿瘤中的高免疫原性neoORF，有力地支持了新抗原作为免疫系统的天然靶标的应用。CASTLE 等［30］使用从头测序来鉴定小鼠黑色素瘤B16F10 中的肿瘤特异性突变，并应用生物信息学算法来预测由这些突变产生的潜在免疫原性表位，通过对肿瘤基因组进行测序系统地鉴定新抗原免疫可以预防和治疗疾病。目前已有基于neoantigen 的个性化肿瘤疫苗治疗恶性黑色素瘤的成功案例［10，31］。

个性化的癌症新抗原疫苗方法是可行的，并且多个临床试验试验结果也有力的支持了这项研究的开展。因此，笔者相信随着研究的进一步开展，基于新抗原的个性化疫苗必将成为一种成熟而成功的针对实体瘤的治疗方案，也将大大推动肿瘤精准免疫疗法的研究进展。

3.2 新生抗原疫苗可与其他治疗手段协同应用目前的的临床研究进展而言，使基于新抗原的个性化疫苗成为一种成熟而成功的针对实体瘤的治疗方案仍然是一项艰巨的任务。因此，以下建议可能会有所帮助。

3.2.1 多表位疫苗接种产生含有MHCⅠ类限制肽和MHCⅡ类限制肽的多表位疫苗，增加新抗原特异性T 细胞的广度和多样性，是克服表位缺失的良好解决方案［27］。在临床试验中使用的大多数新抗原疫苗，包括多肽疫苗（NCT00683670、NCT01970358和NCT02427581），编码多表位的RNA或基于DNA 的疫苗（NCT02316457、NCT02348320和NCT03122106），含有尽可能多的突变信息。可能起到引发强大的抗肿瘤作用并且会诱发免疫逃逸的出现。LI 等［32］设计一种基于盐水的多表位肽疫苗，癌症患者给药后的临床结果表明肺部多个肺肿瘤结节迅速肿瘤缩小。然而，在开始接种疫苗后8 周，患者死于癌转移至肝部引起的并发症。癌转移是疫苗治疗难以治愈的，可能是由于肿瘤异质性以及为了鉴定新抗原而获得的样品仅含有主要部位的原因。改变肽构型成为一个新研究方向，SIMANOVICH 等［33］合成了一个表位EMMPRIN，作为八分支多抗原肽，用该肽疫苗接种证明可抑制小鼠的肿瘤生长和转移。

3.2.2 免疫佐剂和递送系统在没有炎症和∕或微生物刺激时，处于稳定状态的树突状细胞DCs 捕获并处理抗原，会由于免疫耐受而无法诱导强的免疫应答。因此，需要开发有效的免疫佐剂和疫苗递送系统［34］。经典佐剂包括TLRs 受体激动剂和将抗原靶向DCs 的单克隆抗体。TLRs 受体激动剂通过模拟微生物刺激和增强肽疫苗免疫原性，进而诱导免疫应答。将抗原靶向DCs 的单克隆抗体，包括抗DEC205 和CD40 激动剂，可以起到将新抗原导向最强抗原呈递细胞的作用，这可以通过增加抗原呈递效率来和改善疫苗接种的抗肿瘤活性来实现。目前，最理想的疫苗递送载体是纳米颗粒。纳米粒子模仿病原相关分子模式并被抗原递呈细胞上的TLR 受体识别，起到增强基于纳米粒子的疫苗摄取的作用［35］。实验结果显示，在纳米颗粒上装载新生抗原制备成纳米疫苗，最终会诱导更强烈的针对新生抗原特异性的CD8+T 细胞免疫应答，并且显示出显着抑制小鼠中的肿瘤进展。

3.2.3 与其他种类的免疫疗法结合使用由于PD-1信号传导途径对CTL 抗肿瘤反应发挥强烈的免疫抑制作用，因此新抗原疫苗与免疫检查点抑制剂的偶联能够产生更广谱的T 细胞抗肿瘤反应。OTT 等［10］证明新生抗原疫苗诱导持续的免疫应答，扩大新生抗原特异性T 细胞组成部分。SAHIN等［31］报道了患者对PD-1 阻滞疗法和新抗原疫苗接种的联合用药疗法产生了完全反应。由此可见，利用联合免疫疗法可以提高新生抗原的个体化疫苗的临床应用前景。

3.2.4 与传统疗法相结合分子靶向药物可以在大多数具有靶向突变的患者中引起显着的反应。但是，应答的持续时间有限［36］。研究显示具有较高应答效率的基因组靶向疗法诱导肿瘤细胞死亡，导致肿瘤相关抗原和新抗原的释放。从作用机制来讲，靶向治疗与新抗原疫苗疗法具有协同作用。最近，人们越来越关注放射疗法对抗肿瘤免疫应答激活的影响，而且研究证实放射疗法与新抗原疫苗疗法也可以产生协同抗肿瘤作用［37］。因此，将新生抗原疫苗的个体化免疫疗法与传统疗法相结合，是未来非常有潜力的抗肿瘤免疫替代疗法。

4 潜在问题

尽管取得了很大的进展，但新生抗原疫苗的开发仍存在许多挑战。首先，必须降低制造新抗原疫苗的成本和时间。尽管DNA∕RNA 测序的成本显着降低，但鉴定和验证候选新抗原仍然是昂贵且耗时的［38］。在良好生产实践条件下制备新抗原疫苗也非常昂贵。目前，从组织采集到疫苗递送的时间范围为3 至5 个月［10，31］。其次，新抗原预测算法需要进一步优化，包括更好地预测MHCⅠ类和Ⅱ类新抗原的策略，以及由错义突变以外的遗传改变引起的潜在新抗原，例如基因融合和插入缺失。最近发现CD4+T 细胞对新抗原疫苗的反应比CD8+T 细胞反应更常见，即使当基于预测的MHCⅠ类结合对疫苗中包含的新抗原进行优先排序时，依然可以改善新抗原预测算法。另外，与对小分子药物疗法相比，癌症免疫疗法的临床反应具有不同的动力学。通常使用免疫相关反应标准（irRC）评估癌症免疫疗法［39-40］。新生抗原疫苗也将利用这些免疫相关的反应标准，但是，在达到临床终点之前，还将依靠有效的免疫监测来评估疫苗诱导的免疫反应。不幸的是，仍然缺乏可靠的免疫反应生物标记物。需要进一步研究以使用系统方法鉴定相关的免疫应答生物标记物。JANETZKI 等［41］研究发现ELISPOT 的实验室间变异可高达50%。但是从标本库，分析验证到结果报告的标准化和统一程序对于成功的临床开发是必要的。因此，从长远来看，基于新生抗原的个体化疫苗是未来免疫疗法的重要研究方向，但是就当前的技术手段来看，依然还有许多不稳定因素需要去克服。