简述禽网状内皮增生组织病毒危害及其P30蛋白免疫抑制功能

2019-02-12相英杰陈宇桐王一新

兽医导刊 2019年14期

相英杰陈宇桐王一新

（山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000）

1 禽网状内皮组织增生症综述

1.1 病原学

REV属反转录病毒科，γ逆转录病毒属，禽C型肿瘤病毒。目前已经成功分离30多株REV，虽然不同菌株之间的致病性不同，但它们都具有相对一致的抗原，因此REV只具有一个血清型。除了REV-t菌株外，不同菌株之间有相似的结构和化学特征。根据单克降体试验以及中和试验反应等实验，可将REV分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三个亚型，其中Ⅰ型具有A，B，C三个抗原表位，Ⅱ型只具有B抗原表位，Ⅲ具有A，B抗原表位。

1.2 流行病学

REV的主要宿主包括火鸡，鸡，鹅，鹌鹑等，最易感染火鸡。REV主要感染日龄较低的鸡。其既可以水平传播，也可以垂直传播，但主要依靠水平传播。水平传播的途径包括病鸡的排泄物和分泌物经口感染以及健康及接种受到RVE污染的弱毒疫苗。此外，吸血昆虫也可传播疾病。

1.3 致病机理及危害

目前，REV诱发鸡体免疫抑制的分子机制目前尚未完全阐明。REV的P30衣壳蛋白由病毒gag基因所编码，是RE的群特异性抗原团。REV可引起极强免疫抑制，其靶细胞为淋巴细胞或网状内皮细胞，严重影响机体免疫系统，激活机体体液免疫和细胞免疫，降低机体对其他抗原免疫应答。

2 P30蛋白免疫抑制功能研究实验

2.1 实验目的

报道显示，J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus-j，ALV-J）与REV同属反转录病毒科，ALV-J的P27核衣壳蛋白能够下调细胞因子、先天免疫接头蛋白分子的表达水平，从而抑制宿主的先天免疫。因此推断REV表层蛋白P30具有相同治病原理。

2.2 主要实验试剂及器材

标准分子量蛋白 Marker、HRRP标记的抗体；琼脂粉；脱脂奶粉、甲醇、电泳缓冲液、转膜缓冲液；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒；SDS-PAGE Gel Kit；DMEM；鼠抗DTMUV抗体；其他试剂为国产分析纯。

电热恒温培养箱；台式恒温振荡器；各量程（最大量程分别为10 μl、50 μl、200 μl及1 000 μl）的微型移液器；台式高速冷冻离心机；超净台；PCR仪；Gdldoc EQ凝胶成像仪；紫外分光光度计；蛋白垂直电泳槽与核酸水平电泳槽；CO2细胞培养箱；酶标仪；荧光定量PCR仪；倒置荧光显微镜；化学发光成像系统。

2.3 实验步骤简述

2.3.1 REV p30基因真核表达质粒的构建

将REV分离株LN1201感染CEF鸡胚成纤维细胞被REV分离株LN1201感染，LN1201株p30基因序列通过PCR扩增，连入pcDNA3.1真核表达载体前经过双酶切，构建p30基因的真核表达质粒pcDNA-p30。

2.3.2 真核表达质粒pcDNA-p30的瞬时表达和鉴定

将脂质体2000转染到CEF。转染72h后，以前期制备成功的小鼠抗REV P30多克隆抗体为一抗，以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，鉴定pcDNA-p30的表达使用间接免疫荧光试验（IFA）。同时，取另外一部分转染了pcDNA-p30的CEF，先用RIPA裂解液裂解，再用湿转法转至PVDF膜，小鼠抗REV P30多克隆抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，通过western blot试验鉴定其表达。

2.3.3 过表达p30蛋白对CEF细胞中细胞因子和抗病毒因子表达水平的影响

使用六孔培养板接种CEF细胞，培养过夜。后用脂质体2000，将真核表达质粒pcDNA-p30转染CEF细胞，与此同时转染空载体质粒pcDNA3.0作为对照。转染48h后，加入20μl 浓度为1μg/ml的 LPS或者20μl浓度为5μg/ml的 poly（I：C）刺激细胞，在刺激后的第1、6、12、24和48h不同时间点分别收集细胞，通过real-time PCR检测pcDNA-p30转染CEF和空载体pcDNA3.0转染CEF中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-α等细胞因子，以及MYD88、TAK1、IRAK-4、NF-κB、TRAF-6、IRF-7和TRIF等相关抗病毒因子的表达情况。最后，使用ELISA试剂盒，检测细胞上清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-α、IFN-β、TNF-α和TNF-α等细胞因子的含量，分析REV P30蛋白对CEF先天免疫功能的抑制作用。