饲用芽孢杆菌在动物肠道内的作用机理及其应用研究进展

2019-02-12宦海琳闫俊书徐小明周岩民周维仁

饲料工业 2019年11期

■张干宦海琳闫俊书徐小明周岩民周维仁*

（1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京210014；2.南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095）

20 世纪50 年代，抗生素的发现解决了畜牧业生产力偏低、动物抗逆性弱等问题，对推动畜牧业的高速发展做出了巨大贡献。随着抗生素的使用和畜牧业的发展，药物残留、环境破坏、人畜争粮等问题日益严重。自2006年欧盟等国家禁止在动物饲料中添加抗生素后，我国也开始了抗生素替代技术和提高生产效益方法的探索。微生态制剂是指在现代生物工程、发酵工程和细胞工程理论指导下，经特殊工艺制成的活菌制剂，可通过取代或调节胃肠道菌群平衡来解决畜禽养殖中所产生的生长缓慢、疾病多发、生产效益低等问题，并不会产生相应的副作用，被称为抗生素的有效替代品。微生物发酵饲料是一种新型的饲料资源，是指在人工控制条件下，以植物性农副产品为主要原料，通过微生物的新陈代谢和菌体繁殖，将饲料中难以被消化利用的大分子物质和抗营养因子分解转化，产生利于动物采食和利用的富含益生菌及其代谢产物的饲料。发酵饲料具有适口性好、易消化吸收、营养价值高、富含益生菌等特点，可有效替代普通饲料，解决环境破坏、人畜争粮等问题。芽孢杆菌作为农业部允许添加的益生菌之一，具有耐高温、耐酸碱、易培养、耐贮藏、加工损失少的特点[1]，使得其在微生态制剂和发酵饲料上得到了广泛的应用。

1 芽孢杆菌

芽孢杆菌属(Bacillus)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤、空气、水、植物体和动物肠道中[2]。芽孢杆菌属的主要特征：细胞杆状或球状，(0.3～2.2) μm×(1.2～7.0) μm，多数运动，侧生鞭毛，形成耐热的内生孢子。菌落主要特征：不透明、褶皱、乳白色或褐色、产色素、肉汤培养有菌膜生长，pH 值为5.5～8.5，严格好氧或兼性厌氧；有机化能营养，可利用多种底物进行严格呼吸代谢、严格发酵代谢或呼吸和发酵兼具的代谢[3]。此外，芽孢杆菌的生理学特性很广，包括：①产酶；②产生抗菌物质；③硝化作用；④反硝化作用；⑤固氮；⑥沉淀铁离子；⑦还原硒和镁离子等。目前研究和应用最广的主要以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等饲用芽孢杆菌为主。

2 饲用芽孢杆菌在动物肠道内作用机理

2.1 维护和调节肠上皮层屏障功能

肠上皮层主要由肠上皮细胞和连接复合物构成。研究表明，病原菌会导致肠道通透性改变，诱导肠上皮细胞产生大量的IL-8，导致组织发生剧烈的炎症反应，最终引起细胞凋亡与组织损伤[4]；IFN-γ、TNF-α等炎性介质能够引起紧密连接结构发生重排，导致肠上皮屏障损伤，出现功能紊乱[5]。

芽孢杆菌进入肠道后，可通过新陈代谢产生多种营养物质和活性因子，促进肠道上皮细胞的发育和修复，抑制细胞凋亡，并且可有效防止病原菌对肠道的侵害，提高肠道的抗氧化能力和抗炎能力。张甜甜等[6]发现，枯草芽孢杆菌肽聚糖可有效保护由β-conglycinin诱导引起的鲤肠上皮细胞氧化损伤，提高肠上皮细胞抗氧化能力；高浓度肽聚糖能够抑制致炎因子分泌，促进抗炎细胞因子的基因表达，提高肠上皮细胞的抗炎能力。当病原菌、炎性介质等引其肠道IL-6、TNF-α等致炎因子表达量增加时，芽孢杆菌可抑制其分泌，减少炎性因子的基因数及其表达量；提高IL-10、TGF-β等抗炎因子、防御素等抗菌因子、CCL28及其受体CCR10 等趋化因子mRNA 的表达量。研究表明，肠产毒性大肠杆菌会导致猪肠道上皮细胞中IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1α的mRNA表达量显著增加，解淀粉芽孢杆菌处理后其炎性基因数量及表达量显著降低[7]。Yang 等[8]发现，口服芽孢杆菌混合物能够提高猪小肠中TLR4、NOD2、iNOS、IL-8、IL-22、趋化因子CCL28及其受体CCR10的mRNA的表达量。此外，芽孢杆菌能够促进MUC2分泌细胞发育及分泌，调节黏膜屏障渗透性，提高屏障信号通路中相应酶的分泌量及活性，提高ZO-1、OCLN、JAM2 等紧密蛋白基因表达量，可有效防止病原菌和炎性物质对肠道屏障的侵害，保护紧密连接结构的完整。Kong 等[9]用嗜水气单胞菌攻毒草鱼后发现，草鱼出现肠黏膜屏障和炎症反应，饲喂枯草芽孢杆菌可防止Na+、K+-ATP 酶和Ca2+、Mg2+-ATP 酶活性的降低，缓解渗透性增加和炎症。与攻毒组相比，枯草芽孢杆菌保护了肠绒毛和紧密连接结构的完整性，抑制了嗜水气单胞菌诱导的ZO-1、OCLN 表达量的下调；及TJ 蛋白claudin b、TNF-α、IL-8、IL-1β和MyD88mRNA水平的上调。

芽孢杆菌能够通过对肠道上皮细胞和紧密连接结构的维护和调节，从而提高畜禽机体对于病原菌的抗逆性，防治炎症介质引起的炎症反应，维持和修复肠上皮层屏障功能的正常运作。

2.2 促进肠道免疫系统的发育及其免疫应答

肠道是畜禽与外界环境最先接触的部位之一，也是体内最大的免疫器官。当病原体进入胃肠道后，会经M细胞、树突细胞等抗原呈递细胞送至黏膜固有层和腺体中，T细胞和B细胞产生应答后，引起浆细胞增殖分化，产生大量相应抗体，清除病原菌[10]。

芽孢杆菌进入肠道相关淋巴组织以及黏膜免疫系统，经巨噬细胞识别产生相应活化信号后，可诱导和调节T细胞的分化及免疫应答，促使B细胞分化产生浆细胞，提高免疫球蛋白的分泌，促进机体的抗炎作用。Mou 等[11]报道指出，枯草芽孢杆菌可将树突状细胞迁移至MLN 并诱导免疫应答，提高仔猪粪便中特异性sIgA、IgG 含量和血清中中和抗体含量。并且芽孢杆菌可促进T细胞、B细胞、腹膜细胞等免疫细胞的发育和修复，调节其分泌产生免疫球蛋白和抗炎因子[12]。此外，芽孢杆菌能够分泌多种功能蛋白，可有效促进肠道内淋巴细胞的发育和分化，调节其免疫应答。Novak 等[13]研究表明，芽孢杆菌能够促进T 细胞亚群的发育，提高CD8-CD25+细胞、CD8-CD45RO+细胞、CD8-TCR1+细胞、分泌L-选择蛋白的单核细胞和粒细胞的比例。Lee 等[14]报道指出，枯草芽孢杆菌衍生的聚-γ-谷氨酸能够刺激树突细胞产生IL12，导致CD4+T 细胞向Th1 表型分化，并诱导其产生IFNγ、TNFα、IL12等，增强其对肿瘤细胞系的细胞毒性。

芽孢杆菌能够有效地促进肠道免疫防御系统的发育和完善，调节其免疫应答类型，加速免疫应答反应，从而提高机体对于疾病的抗逆性和免疫能力。

2.3 调节肠道微生物区系平衡

畜禽肠道中栖息着大量微生物，这些微生物在与宿主长期共同进化过程中形成了稳定的共生关系。肠道微生物在刺激免疫系统发育、抑制病原菌繁殖、调节肠道内分泌功能及神经信号、合成维生素等过程中发挥重要作用[15]，被认为是肠道黏膜屏障的重要组成部分[16]。

调节肠道菌群是芽孢杆菌最直接的作用机制，其能够与病原菌竞争黏附位点和代谢底物，并可通过分泌乳酸和短链脂肪酸，来降低肠道pH值，改变肠腔微环境，从而抑制致病菌生长繁殖，调节肠道微生物区系平衡。同时，芽孢杆菌能够诱导抗菌肽、细胞因子、炎性因子及趋化因子的产生与释放，激活吞噬细胞清除病原体，防止其对肠道菌群的侵害，从而维护肠道菌群的平衡。此外，芽孢杆菌在生长繁殖过程中能够分泌多种消化酶、抗菌物质、营养物质等。这些物质除了能够有效促进畜禽肠道的发育和消化吸收，改善其肠道形态，提高生长性能外，还可有效地杀灭肠道内的病原微生物，促进有益菌群的附着和生长，维持肠道健康和菌群区系平衡。研究表明，玉米赤霉烯酮会引起小鼠肠道菌群结构发生紊乱，乳酸杆菌等有益菌群减少，大肠杆菌等有害菌群增多，而蜡状芽孢杆菌可有效改善应激引起的肠道菌群的失衡，增加乳杆菌的丰度，维持小鼠肠道菌群的健康[17]。Al-Fataftah等[18]研究报道指出，热应激会显著降低肉鸡肠道活菌数、乳杆菌和双歧杆菌的吸收上皮细胞面积；膳食添加枯草芽孢杆菌可有效逆转应激所产生的影响，降低梭菌和大肠杆菌的活菌数。

芽孢杆菌进入肠道后能够通过生物夺氧、竞争性抑制、分泌抗菌物质等多种方式抑制病原微生物的生长繁殖，促进有益菌群的附植和繁殖，从而调节肠道菌群的区系平衡，促进机体对于营养物质的消化吸收，提高生长性能。

3 饲用芽孢杆菌的应用

3.1 饲用芽孢杆菌在微生态制剂上的应用

3.1.1 促进生长，改善生产性能

芽孢杆菌能够分泌多种酶类，包括蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等，这些酶类能将饲料中无法吸收的抗营养物质分解成小分子物质，提高饲料的利用率，促进畜禽的消化吸收；芽孢杆菌还能够合成多种营养物质，如：B 族维生素、氨基酸等，这些营养物质能够加速畜禽的生长，改善其生产性能。同时，芽孢杆菌能够有效促进肠道及其形态的发育，提高肠道对于营养物质的消化吸收。此外，芽孢杆菌制剂替代抗生素后，可有效提高畜产品的品质和安全。Reis 等[19]报道中指出，日料添加枯草芽孢杆菌能够有效促进肉鸡对干物质、粗蛋白的消化吸收，提高饲料效率，改善畜禽生长性能。Balasubramanian 等[20]研究表明，日料添加复合芽孢杆菌制剂能够提高生长育肥猪的平均日增重、饲料效率和干物质消化率，改善猪肉品质。Sikandar 等[21]发现，枯草芽孢杆菌能够显著提高肉鸡平均体重和饲料转化率；与对照组相比，十二指肠和回肠的绒毛高度、十二指肠和空肠的绒隐比显著提高。

3.1.2 防治疾病，提高免疫能力

芽孢杆菌在肠道生长繁殖过程中可通过竞争性抑制作用阻止有害微生物在肠黏膜上的附植与繁殖，防止致病菌在肠道黏膜上皮细胞间的移位，抑制病原微生物的生长。同时，芽孢杆菌能够促进肠道免疫系统的发育，调节相应的免疫应答类型，促进抗体、免疫蛋白、活化因子等免疫物质的分泌。并且，芽孢杆菌可对肠道黏膜屏障功能进行调节，可有效提高机体的抗逆性和免疫能力，减少肠道疾病的发生。此外，枯草芽孢杆菌能够分泌多种抗菌物质和营养物质，能够有效促进有益菌群的繁殖，抑制病原微生物的生长，保护肠道健康。Zhang 等[22]研究表明，地衣芽孢杆菌饲喂三角鲂后，其血清中替代补体活性及总血清蛋白和球蛋白含量显著增加；此外，实验组中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及血浆和肝脏中超氧化物歧化酶活性显著高于对照组，而丙二醛含量则相反。Yang等[23]在断奶仔猪日粮中添加枯草芽孢杆菌后发现，枯草芽孢杆菌能够通过上调肠道IL-22表达缓解大肠杆菌诱导的小肠炎，提高ZO-1表达水平改善肠上皮屏障完整性，提高断奶仔猪的抗逆性和免疫能力。

3.1.3 净化养殖环境

芽孢杆菌能够提高畜禽对于氮、磷的利用率，减少养殖过程中废物的产生；其生物同化作用可有效清除畜禽养殖舍内粪便所产生的恶臭味道。此外，芽孢杆菌及其代谢产物能够抑制病原菌和蚊虫的生长繁殖，在圈舍内或发酵床垫料中添加芽孢杆菌能够有效防止疾病的发生，改善畜禽养殖环境。有报道指出运用枯草芽孢杆菌制作微生物矿物质制剂能够有效去除空气中氨和硫化氢的含量，2 d后可分别减少94%和60%[24]。畜禽养殖过程中会产生粪便、废渣、废水等污染物，通过杆菌处理后，可使其转化为优质肥料、新型垫料等。Xue等[25]发现，枯草芽孢杆菌能够通过固体发酵过程将食物垃圾和长石转化为钾生物肥料，并且钾的溶解率可达41.53%。董书阁等[26]发现，畜禽粪便和作物秸秆能够制备发酵床垫料，制成的发酵床垫料中富含酵母菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸菌等益生菌，用于猪养殖后，可促进猪的生长，降低猪的发病率。

3.2 饲用芽孢杆菌在发酵饲料上的应用

3.2.1 芽孢杆菌发酵饲料的效果

畜禽饲料含有许多脲酶、棉酚等抗营养物质，芽孢杆菌能够分泌多种酶类，通过发酵可有效去除这些物质，提高饲料的消化吸收率和营养价值。芽孢杆菌发酵的饲料具有良好的适口性和营养价值，含有大量的有益活菌及其代谢产物，能够有效的促进畜禽的生长发育，提高其生产性能。此外，饲料通过发酵后能够产生大量的有机酸，可降低消化道内pH值，促进矿物质元素钙、磷、铁以及维生素D的吸收与利用。Sun等[27]发现，利用地衣芽孢杆菌对玉米秸秆进行有效降解，发酵后，纤维素、半纤维素和木质素的降解率可达35.42%、17.47%和20.19%。Ali 等[28]发现，使用枯草芽孢杆菌发酵大豆，能够显著提高其TPC、总氨基酸、DPPH、ABTS自由基清除活性和棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸含量；发酵后的大豆，钙、铁、钠和锌含量分别从1 481.38、41.38、32.82、48.01 mg/kg 提高到1 667.32、317.00、310.07、73.18 mg/kg。

3.2.2 在家禽养殖中的应用效果

芽孢杆菌发酵饲料饲喂家禽可有效提高其生长性能和生产性能，改善家禽的体成分组成和肠道菌群区系平衡，提高其抗氧化能力和免疫能力。Ashayerizadeh 等[29]研究表明，芽孢杆菌发酵菜籽粕饲喂肉仔鸡能够提高其增重率和饲料转化率，降低其血清甘油三酯、极低密度脂蛋白和胆固醇浓度；此外，发酵菜籽粕降低了肉鸡腿肌中胆固醇和丙二醛浓度、总饱和脂肪酸含量，提高了其总不饱和脂肪酸含量；与对照组相比，乳腺和大腿肌肉的总超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力显著提高。Chen等[30]研究表明，兰德斯鹅饲喂枯草芽孢杆菌和酵母菌发酵饲料后，其腿肌相对重量、采食量和肝脏比显著提高，肠道内乳酸杆菌和大肠杆菌含量较对照组显著提高；此外，其血液胆固醇水平、心脏和肝脏丙二醛含量显著降低，谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性明显升高。廉俊红[31]发现，枯草芽孢杆菌、酵母菌等复合益生菌发酵饲料后，饲喂雪峰乌骨鸡，其平均日采食量、粗蛋白和粗脂肪表观消化率显著提高，剪切力、蒸煮损失、滴水损失等指标降低，肌肉干物质和粗蛋白含量显著增加，表明乌骨鸡的肉品质得到显著改善。

3.2.3 在家畜养殖中的应用效果

芽孢杆菌发酵饲料饲喂家畜后，可显著提高其对营养物质的表观消化率，促进其肠道的消化吸收，改善生长性能，提高家畜的肉品质和乳品质，维持肠道菌群平衡，增强其抗逆性、抗氧化能力和免疫能力。胡新旭等[32]研究表明，饲喂断奶仔猪枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌等菌种发酵的饲料后，其腹泻率显著降低；仔猪肠道内乳酸菌数量显著提高，大肠杆菌数量明显降低；与对照组相比，仔猪血清碱性磷酸酶活性和葡萄糖、总蛋白、免疫球蛋白G含量显著提高，血清尿素氮含量显著降低；此外，粗蛋白和粗纤维表观消化率显著高于对照组。彭忠利等[33]研究表明，用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌发酵的饲料饲喂山羊后，其日增重显著提高；粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的表观消化率显著提高；此外，血清尿素氮含量和发病率显著低于对照组。吴小燕等[34]报道指出，枯草芽孢杆菌、乳酸菌等发酵的饲料能够提高奶牛的全期产奶量、乳成分含量、乳密度、乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量显著高于对照组，干物质、粗蛋白质和酸性洗涤纤维的表观消化率显著提高。Zhe等[35]研究表明，利用芽孢杆菌和肠膜明串珠菌制作发酵饲料饲喂奶牛后，饲粮各养分的表观消化率显著提高，其产奶量、乳蛋白质百分比、乳脂率和乳糖DM百分比显着高于对照组。

3.2.4 在水产养殖中的应用效果

芽孢杆菌发酵饲料可提高水产动物对饲料的利用率，改善生长性能和体成分，提高机体的抗氧化能力和免疫能力。Jiang 等[36]研究表明，用枯草芽孢杆菌、乳杆菌等混合菌发酵豆渣饲喂大口黑鲈后，可显著提高其末均重、特定生长率、蛋白质效率比，降低其肝体指数、内脏比和肝脏脂质含量；并且，显著提高血浆中的总蛋白质含量、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶活性，降低其丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸转氨酶含量；此外，血浆中甘油三酯、总胆固醇、葡萄糖和丙二醛含量显着降低。Hassaan 等[37]利用枯草芽孢杆菌发酵向日葵粉后发现，其粗蛋白、脂质含量、必需氨基酸含量增加，纤维含量、绿原酸、咖啡酸、植酸和皂苷含量下降；喂养尼罗罗非鱼后，其血清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶活性、磷、钙、胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白含量显著降低。Rahimnejad 等[38]用发酵豆粕替代鱼粉饲喂日本海鲈后发现，未发酵豆粕会显著降低海鲈的生长速率、蛋白质消化率、干物质消化率，导致其血清总抗氧化能力降低，丙二醛浓度增加；芽孢杆菌发酵豆粕替代鱼粉，不会影响海鲈的生长性能，还可提高其血清中溶菌酶和补体C3活性，并降低TNF-α和IL-1β促炎基因的表达，提高抗炎TGF-β基因的表达；即芽孢杆菌发酵豆粕有利地影响了日本鲈鱼的饲料利用率，抗氧化能力和先天免疫力。