非洲猪瘟的诊断方法概述

朱向博，张 丽*

（1.太原动物园，太原 030009；2.陆生野生动物疫源疫病监测站，太原 030009）

非洲猪瘟（ASF）由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起，属于高度接触性传染病，所有品种和年龄的猪均易感。家猪感染后因感染毒株和猪品种的不同，死亡率5%～100%。野猪感染后因野猪种类不同而临床表现差异很大，其中欧亚野猪、美洲野猪的临床表现与家猪类似，而非洲的疣猪、丛林野猪等多呈隐形感染，北美的花斑野猪对本病具有抵抗力[1]。根据世界动物卫生组织（OIE）发布的2019版动物疫病通报名录，ASFV 感染为需通报的动物疫病。我国把ASF划为一类动物疫病，是采取紧急严厉的强制预防、控制、扑灭的对象。

中国首例ASF病例发生于2018年8月3日沈阳某养殖户，存栏猪383头，47头发病并死亡，病料检测ASFV 核酸阳性。根据中国动物卫生与流行病学中心的统计数据，截至2019年3月13日，ASF肆虐中国28个省，发布疫情113起（其中3起为野猪疫情），此次ASF 疫情对中国整个猪养殖业造成了巨大的经济损失。根据OIE官网统计数据，仅2018年9 月28 日～2019 年3 月1 日，中国因ASFV 感染致死及淘汰的猪只数量达到257 005头，ASF在不到一年的时间给中国养猪产业造成了巨大的经济损失。

目前，ASFV 感染尚无有效的疫苗，主要通过检疫、扑杀来控制其暴发流行。因此，科学有效的检测诊断方法是防止ASF大范围暴发流行的有效手段。以下就ASF的诊断方法予以介绍。

1 ASF病原学及流行病学

1.1 病原学

ASFV 是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属中的唯一成员。ASFV 能在鸡胚卵黄囊中培养生长，大多数毒株能在猪单核细胞、骨髓细胞和白细胞内生长。ASFV 基因组为一条双链DNA 分子，170～190 kb（跟猪瘟病毒的基因组12 kb 相比，大小相差15倍），可编码150～200种蛋白质，基因型多达24 个，8 个血清群（ASF 很少产生中和抗体，所以无血清型概念，但可通过红细胞吸附试验分成8个血清群），不同血清群之间交叉保护力比较差。病毒变异性强，抗感染机制十分复杂，能诱导易感动物产生高滴度抗体，但该抗体是由非中和抗原激发，不是中和抗体，不具备免疫保护作用。病毒入侵猪体主要在网状内皮细胞、单核巨噬细胞以及淋巴细胞中复制，造成细胞凋亡，进而导致机体免疫功能低下或不全，严重影响宿主的免疫系统[2]。

ASFV对温度敏感，55 ℃30 min或60 ℃10 min可灭活。室温条件下，在粪便中可存活11 d，腐败血液中15 d；4 ℃条件下，在血液中存活18月；在腌制干火腿中可存活150 d；在冷冻猪肉内可存活15周，骨髓中达6个月；在半熟肉以及泔水中也可长时间存活。ASFV 非常稳定，对热、腐败、酸碱和蛋白酶均具有较高耐受性。ASFV 对乙醚和氯仿等脂溶剂敏感，消毒剂中季铵盐、碘制剂和苯酚类效果较好，而0.8%NaOH、含2.3%有效氯的次氯酸盐、0.3%福尔马林以及3%邻苯基苯酚均可在30 min内将其灭活[3]。

1.2 流行病学

ASFV感染是一种高度接触性猪传染病，ASFV是唯一的虫媒DNA 病毒，软蜱或非洲钝缘软蜱是其主要贮藏宿主和传播媒介。软蜱不仅可长期携带病毒，也可通过交配和卵传递病毒。软蜱通过叮咬使猪感染，同群猪通过接触带毒猪的分泌物、排泄物感染。养猪场的猪主要以染毒的饲料、车辆、清洁工具，以及带毒的种猪精液等传播。ASFV 可在猪体外长期存活，所以感染猪的流动是最常见的传播方式，加之蜱虫这一流动性媒介，造成ASFV难以根除。

2 ASF临床症状及解剖学诊断

2.1 临床症状

ASFV 临床症状与经典猪瘟（CSF）非常相似。最急性病例多在发病初期突然死亡，症状不明显。急性病例症状最为典型：体温升至40～41 ℃，高热持续约4 d，直到死前48 h，体温下降，同时临床症状直到体温下降才突显出来，表现为食欲废绝，四肢、耳、皮肤发绀伴有分散性出血，眼、鼻有浆液性或黏液性脓性分泌物，呼吸系统和神经系统功能性紊乱，咳嗽，共济失调等。有些毒株会引起带血下痢，呕吐，病程5～7 d即死亡。耐过猪终生带毒，但不出现症状，变为隐形感染，病毒血症持续几个月或几年，易发生继发性传染病[4]。

2.2 解剖病理学

同其他出血热病毒一样，ASFV 可导致血管内皮细胞凋亡，使血管通透性增加，从而引起内脏实质性器官表面广泛的出血性病变。急性、亚急性的病变特征为广泛性出血及淋巴组织破坏引起的出血性浆液性炎。主要侵害脾脏、淋巴结、心和肾脏等。脾脏异常肿大至原来的200%～300%，色泽变深，质脆，出血性梗死，髓质区切面突起；淋巴结出血，切面呈大理石状，有血肿样结节；心包积聚大量浆液性液体，心内外膜有小点状、淤斑状出血；肾脏皮质、肾盂的切面也有小点出血；肝脏肿大，表面有点状出血，肝门淋巴结出血，呈黑褐色，胆囊水肿[5]。

ASFV 单独感染的情况下，根据典型的临床症状和解剖病理变化，可初步判断结果，混合感染情况下临床症状和病变出现多样化，不具典型性，初判较困难。一般来讲，ASF的最终确诊需依靠实验室诊断。

3 ASFV的实验室诊断

3.1 ASFV的实验室常规诊断方法

ASFV 的实验室常规诊断主要有病原学、血清学方法，以下重点介绍实用性广的动物接种实验和酶联免疫吸附实验（ELISA）。

3.1.1 动物接种实验

该方法是OIE推荐的标准诊断方法之一。用疑似ASFV感染的病料直接接种或接触无特定病原体（SPF）猪，若SFP 猪发病，则为ASFV 感染，若不发病，则不是ASFV感染。对动物接种实验的疑似感染猪，可进行二次接种试验做进一步诊断。该方法是诊断ASFV感染的金标准之一，具有准确性高，实验要求不高的优点，但是病毒接种后，根 据接种毒株的不同及病料中病毒含量的不同，SPF猪发病需要2～7 d，病猪出现典型症状需要5～7 d，不适用于ASFV爆发期的诊断。

3.1.2 ELISA ELISA分为抗原检测和抗体检测两种，其中抗体检测ELISA（间接ELISA、iELISA）为OIE 国际贸易指定试验，《OIE 陆生动物诊断试验和疫苗手册》中以全病毒抗原包板，借以吸附血清中的ASFV 抗体，然后以辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌蛋白A（HRP-SPA）与ASFV抗体结合，最后加入底物，阳性样品有显色反应。美国kernel 公司出品的ASF 抗体试剂盒，基于间接ELISA，能检测家猪或者野猪的血清中的ASFV 抗体。与OIE 诊断手册不同的是该酶标板上包被了纯化重组ASFVP54 蛋白抗原。ELISA 方法具有操作简单、重复性好的优点，适用于大规模流行病学普查，不适用于ASFV 感染的爆发期诊断，诊断结果还存在假阳性偏高的问题。

3.2 ASFV的实验室分子病原学诊断

分子病原学诊断是检测病料中的病原的DNA或者RNA 核酸，主要有聚合酶链式反应（PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）。PCR自1985年发明以来，经过30 多年的发展完善，已被广泛用于兽医临床疫病诊断中。PCR无需病毒的分离培养，直接检测组织或体液中的病毒核酸分子，具有高效、敏感、准确等优点。LAMP是2000年建立的，操作简便，成本低廉，无需特殊仪器设备（如PCR 仪、电泳设备、凝胶成像系统等），整个实验只需恒温水浴锅或金属恒温仪即可[6]。LAMP 检测技术已经广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等病原的检测研究。LAMP 是一种崭新的DNA 扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点，未来有替代PCR 方法的可能性[7]。

3.2.1 ASFV的PCR检测方法

PCR 是ASFV 主流检测方法，也是OIE 国际贸易指定试验方法。

3.2.1.1 普通PCR检测方法

曾少灵等提取了ASFV灭活病毒的核酸并建立ASFV 的PCR 检测方法，根据VP73 基因设计引物P1 5'-CCA-TGG-TCA-GCT-TCA-AAC-GTT-3'，P2 5'-ATT-TGC-GCA-CAA-GCG-TTG-T-3'，扩增长度251 bp[8]。该方法与OIE 推荐使用的2 组PCR引物进行比对试验，结果表明3组引物的检测特异性相当，而曾少灵的引物检测灵敏度至少高出OIE 引物灵敏度的100 倍。崔尚金等建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法，参照ASFV-P54基因设计引物，扩增出552 bp的目的片段，研究中采用纳米金颗粒作为热导介子，提高了PCR 反应效率，减少了非特异性扩增，其敏感性实验表明：ASFV纳米PCR检测技术是常规PCR检测技术敏感性的1 000倍，最低核酸拷贝数检出量可达10个拷贝[9]。

《SN∕T1559-2010非洲猪瘟检疫技术规范》推荐ASFV 的PCR 检测引物序列为：P1 序列5'-ATGGAT-ACC-GAG-GGA-ATA-GC-3 3'；P2 序 列5'-CTT-ACC-GAT-GAA-AAT-GAT-AC-3'，PCR 反应程序中引物50 ℃退火1 min。紫外光源下观察凝胶，阳性样本可见约278 bp的条带。

2018版《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐ASFV 的PCR 检测引物序列为：上游引物F 5'-AGT-TAT-GGG-AAA-CCC-GAC-CC-3'，下游引物R 5'-CCC-TGA-ATC-GGA-GCA-TCC-T-3'。PCR反应程序中引物62 ℃退火30 s。40个扩增循环后，琼脂糖电泳后成像，阳性样本可见约257 bp的条带。

3.2.1.2 荧光定量PCR

根据《SN∕T 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范》以及2018 版《OIE 陆生动物诊断试验和疫苗手册》，推荐ASFV 的荧光定量PCR 检测引物序列为：P1 序列5'-CTGCT-CATGG-TATCAATCTTATCGA-3'，P2 序 列5'- GATAC-CACAA-GATC（AG）-GCCGT-3'，TaqMan 探针序列：5'-[6-carboxy-fluorescein（FAM）]-CCACG-GGAGG-AATACCAACC-CAGTG-3'-[6-carboxy-tetramethyl-rhodamine（TAMRA）]。40 个 扩 增 循 环 中，58 ℃退 火1 min。扩增曲线Ct＜40 为ASFV 核酸阳性（当Ct＜30时为核酸强阳性样本），当Ct＞40时为ASFV核酸阴性。反应结束的混合液也可琼脂糖凝胶电泳后成像，可见250 bp的条带。

3.2.2 ASFV的LAMP检测方法

江彦增等利用ASFV-P72全基因标准质粒作为模板建立了ASFV 的LAMP 检测方法。特异性好，与其他常见猪DNA 病毒无交叉反应；敏感性上LAMP 法能检测到5 个拷贝的模板，而PCR 方法只能检测到500 个拷贝，LAMP 方法是OIE 推荐PCR方法的100 倍[10]。杨吉飞等针对ASFV 的保守基因VP72建立了ASFV的LAMP检测方法，特异性和敏感性良好，对非洲猪瘟参考实验室馈赠的来自14个国家17株ASFV基因组检测为核酸阳性[11]。该方法可以检测到2 fg 的重组质粒，OIE 参考的PCR 引物可以检测到0.2 fg 的重组质粒，LAMP 的敏感性比PCR的敏感性低10倍。杨吉飞等指出，ASFV感染产生较高的病毒血症，通常在感染的第二天就能从血液中检出，10 倍的敏感性差异并不会影响该LAMP 方法在ASFV 中的检测应用。田纯见等建立了ASFV 的高保守性DNA 聚合酶G1211R 非结构基因的实时荧光LAMP 检测方法，该方法以ASFV E70株病毒核酸为模板，特异性良好，检测灵敏度达到21 pg，优于荧光定量PCR方法[12]。在以ASFV Arm07株制备的各种临床模拟样品检测应用中，检出阳性率比荧光定量PCR方法也略高。

4 小 结

ASFV 感染的实验室检测方法还包括免疫组化法、血细胞吸附实验、荧光抗体实验（FAT）等。其中免疫组化法对于临床症状不明显的病例，确诊有一定难度；血细胞吸附试验作为国际上最经典方法之一，但由于科学家发现了不能吸附红细胞的ASFV，这些毒株能在白细胞培养物内产生细胞病变，但没有红细胞吸附能力，1964—1974 年，分离的无红细胞吸附能力的ASFV毒株多达216株；荧光抗体实验具有快速、经济、敏感性和特异性高等优点，但需要专业试验人员，同时需要荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体，且对亚急性和慢性型ASFV 的检测敏感性仅为40%。所以上述3种方法仅作为ASF的辅助诊断[13]。

PCR、LAMP等分子生物学技术在猪感染ASFV的早期即可检测到病毒核酸，在ASFV的早期检测中具有重要作用[14]。其中LAMP方法是比较新的核酸检测方法，具有操作流程少，设备要求不高，特异性灵敏度高，结果肉眼可判定的优点，但是，LAMP灵敏度高的同时易导致非特异性扩增或假阳性的扩增。这种非特异性的假阳性反应结果严重限制了其推广应用[15-16]。2018版《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐的方法中，没有推荐LAMP 方法检测ASFV，原因可能是LAMP易出现假阳性结果。

在ASFV临床诊断时，各类研究机构报道的方法很多，各种方法从不同角度都能有效诊断该病，但很多不是属于基础性研究，就是对实验室的条件要求比较高，并不能得到有效的实践推广应用。相比较之下，核酸的PCR 检测是无传染风险的检测方法，一般具有检测设备的单位均具有检测资质，而且检测耗时短、准确性高。目前，对ASFV感染的分子诊断，《SN∕T 1559-2010 非洲猪瘟检疫技术规范》标准和《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》均有推荐使用的PCR参考方法。

基因芯片技术（包括传统的固相芯片和液相芯片）也是一种比较新的核酸检测技术，基因芯片技术的优点在于克服了PCR 中的假阳性和假阴性，保证了结果特异性及准确性，而且可对大样本数量进行高效的高通量检测，可用于疫源群体的个体病毒携带情况筛查，做到疫病监测预警，缺点在于技术要求相对较高[17]。目前，ASFV 感染的基因芯片检测的研究鲜见，相信通过众多学者不断的努力研究，技术不断的优化，芯片技术将会在疫病监测方面大显身手。