循环肿瘤细胞及循环肿瘤DNA在胃癌中的研究进展

马晓溪综述，胡莹，普娅坤，周涛审校

(昆明医科大学第二附属医院检验科，云南 昆明 650101)

在我国，2015年新确诊的胃癌病例约679100例，其中死亡人数超过498000例[1]。尽管近年来对于胃癌的诊断和治疗有了较大改进，但胃癌患者的5年生存率仍低于30%，并且大约50%的胃癌患者在手术治疗后复发或转移[2]。早期GC的治疗策略包括外科手术及放化学疗法，而对于进展期胃癌(Advanced gastric cancer，AGC)治疗的主要策略为化疗和靶向治疗。不幸的是，超过40%的AGC患者对化疗药物不敏感，其他患者则迅速产生耐药，这使得患者的生存率低且治疗方法的选择有限[3]。因此，探索新的可靠生物标志物对于提高GC患者的早期诊出率和复发、转移的预测准确率极为重要，且能更好地监测GC患者的治疗反应，进而提高患者的生活质量。

当下三种热门的非侵入性液态活检方法中的循环肿瘤细胞(circulating tumour cell,CTCs)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)因其具备微创性、易获得性和可重复性等优势而受到越来越多的关注[4]。相关研究显示在肿瘤的早期阶段，即有肿瘤细胞和DNA释放至外周血，形成CTCss及游离DNA,且其与肿瘤患者的无进展生存期(Progression Free Survival,PFS)和总生存期(Overall Survival,OS)明显相关[5]，这为我们对胃癌的早期诊断、疗效监测及评估预后的进一步研究提供了新的平台。本文就胃癌中CTCs和ctDNA的生物学特性、检测方法及临床意义进行了综述。

1 CTCs

1.1 生物学特性 CTCs是经过內渗作用进入外周血液的脱离原发灶或转移灶的肿瘤细胞。上皮间质转化(EMT)似乎参与了这项活动，它能增强肿瘤细胞的可塑性和迁移能力，协助CTCss进入血液循环，加速肿瘤转移。然而，并非所有的CTCss都有可能发展成转移灶，大部分进入外周血的肿瘤细胞被宿主自身的免疫系统清除或因血流剪切力而死亡，只有一小部分具有干细胞样或上皮-间充质转换特性的肿瘤细胞可以存活并迁移到远处以形成继发性肿瘤[6]。因此，外周血循环中检测到CTCs可作为癌症发生转移的标识。

1.2 富集和检测 在癌症患者的血液中，CTCss相对于其它细胞浓度较低，因此，需要非常灵敏的方法来检测并计数由包括GC在内的各种恶性肿瘤产生的CTCss。CTCss检测一般分为两步：分离富集和检测。一般来说，富集是基于物理的(如大小或密度)或生物学的(如存在特殊的蛋白质)特性来捕获CTCss，也可以将二者结合起来，以提高CTCss的检测准确性。富集之后，CTCss能够被基于核酸的测定方法(定量实时聚合酶链反应，qRT-PCR)或基于细胞识别的测定方法检测到。qRT-PCR方法被认为是检测肿瘤细胞分子标志物 (如mRNAs)最敏感的方法，可在1-1000万个正常细胞(1-10毫升血液)中检测到一个癌细胞，与qRT-PCR相比，基于细胞识别的测定方法 (例如免疫细胞化学、免疫荧光和流式细胞术)可进行CTCss计数并对细胞的形态及分子特征进行分析[7]。The CellSearch系统是美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的唯一一种基于免疫磁珠捕获上皮细胞粘附分子(EpCAM)的用于富集和检测CTC-ss的系统。Grover[8]等使用这种技术检测了403名转移性结直肠癌患者的血液样本，其中26%的患者检出CTCss。然而，该方法也存在局限性，它不能检测表达水平低的EpCAM和非上皮表型 (如循环肿瘤干细胞的CTCss)。

目前有许多关于CTCss检测的替代方法正在研究中，如 CTCs芯片、“人字形芯片”等[9]。但是，由于每种富集方法可能捕获不同的CTCss群体[10]，故临床使用标准化方法是极为必要的。

2 ctDNA

2.1 生物学特性 循环游离DNA(circulating cellfree DNA，cfDNA)是一种胞外DNA，以单链或双链DNA、DNA蛋白质复合物等形式存在于血液、脑脊液等体液中，部分来源于原发性或转移性肿瘤。来自CTCss的cfDNA也称为ctDNA，包含肿瘤基因的不同片段，这些片段可能会引起癌症的特异性基因或表观遗传的变异，例如甲基化或突变。ctDNA的平均长度约为140个核苷酸，比非肿瘤cfDNA短(约166bp)，长度上的差异可使ctDNA从非肿瘤cfDNA中分离出来[11]。目前，关于肿瘤患者ctDNA的来源主要有以下三个观点：①细胞凋亡或坏死的肿瘤细胞；②循环血液或转移灶中肿瘤细胞的溶解；③肿瘤细胞不断释放DNA进入血液循环。

2.2 检测 一般情况下，血液中ctDNA的含量很少，基因常规测序技术的灵敏度较低，如Sanger测序等检测方法。随着数字PCR和大规模并行测序(MPS)等新技术的出现，ctDNA检测的灵敏度得到了显著提高。数字PCR与常规PCR的不同之处在于，它是一次分配一个样品DNA分子到用于扩增和检测的单个微体积反应中，以实现“单分子模板PCR扩增”，该技术已用于卵巢癌、胰腺癌等癌症的ctDNA分析[12]。该方法的优点是可以对ctDNA进行绝对定量，缺点是能检测到的突变点的数量有限且通量低。MPS是一组能够同时处理多个DNA序列的技术，典型运行的MPS仪器产生数亿至数千兆碱基的核苷酸序列数据，灵敏度为0.001%(1/100,000拷贝)。它的高灵敏度和高通量特点使其成为评估血液中低水平ctDNA的有力手段[13]。目前，基于MPS的ctDNA分析的主要内容是对数十至数百个癌症基因的体细胞突变进行基因面板分析。最新的基于MPS的ctDNA测试平台包括Safe序列、Tam序列、CAPP序列和Ampli序列等。

3 CTCs和ctDNA在胃癌中的应用价值

传统的组织活检被认为是临床诊断癌症的金标准，活检标本的病理学结果也为临床决策提供了基本信息。然而，肿瘤标本来源的局限性、肿瘤动态变化的侵入性和延迟性限制了其应用。与传统的病理组织活检相比，检测CTCs和ctDNA已经被认为是一种具有微创性、便捷性和可动态监测肿瘤变化的液态活检方式，目前已被用于癌症管理的许多方面，例如监测肿瘤复发、治疗效果和预测癌症患者的存活时间等。

3.1 CTCs和ctDNA在胃癌的诊断方面的价值 癌症的早期诊断，特别是在转移之前，对于降低癌症相关死亡率至关重要。目前内镜检查是临床实践中GC诊断最有效的方法，但其对GC筛查的敏感性仅为69.0%[14]并且存在一些突出的缺点。一些患者因害怕侵入性和手术而拒绝进行必要的胃镜检查。通过胃镜检查在全国范围内对GC进行筛查将对欠发达国家的卫生预算造成沉重负担，并且在低发病率地区也不合适。另一方面，一些患者因担心胃癌发生而接受不必要的胃镜检查。因此，需要好的替代方法来识别用于胃镜检查的高风险个体。一般来说，用液态活检来评估、筛查一般人群是不现实的，但可能适合于高危人群(如家族性疾病患者)。

CTCs的检测是一种有吸引力的替代方案，可提供可重复性和非侵入性检测癌症患者治疗效果的能力，且能够提示影像学未能发现的潜在病灶，这有助于患者的早期诊断及个体化治疗，进而提高胃癌患者的存活率。Hwa MK等[15]使用ROC曲线来确定用于区分胃癌患者和健康对照组的CTCs的最佳阈值水平，并将该阈值定义为每7.5mL血液≥2个CTCss，其敏感性和特异性值分别为85.3%和90.3%。许多学者通过临床研究发现，胃癌患者外周血的CTCs阳性率显著高于胃良性疾病患者[15-17]。Tang等[18]为评估CTCs的检测对于诊断GC的总体准确性进行了一项meta分析，结果显示，CTCs检测对GC诊断的特异性为99%。因此，用于GC检测的CTCs的突出特征是其特异性较好，这在GC的诊断确认中可能是有价值的。这些结果表明CTCs可能作为胃癌早期诊断的生物标志物。

过去十年中，在探索ctDNA在癌症患者管理中的临床应用方面取得了相当大的进展。基于ctDNA的液态活检具有微创性和对癌症基因组“实时快照”的特点，在诊断、监测和评估治疗效果等方面已经显示出比常规组织活检更有效和更好的替代潜力。早期癌症患者通常无症状，当癌症相关症状明显时，治愈该疾病往往已为时已晚。一个5000万癌细胞的肿瘤是无法通过成像检测到的，它将DNA释放到循环血液中，可以通过对循环血液中的ctDNA进行分析而检测到[19]。Yunhe Gao[20]等关于混合期胃癌的meta分析中显示，ctDNA检测在胃癌诊断特异性方面具有明显优势。研究发现，肿瘤患者循环血中cfDNA通常较健康者高，且这部分患者cfDNA的生物学特征与肿瘤组织相同，说明肿瘤患者中循环肿瘤DNA是循环游离DNA的主要来源。Kim等人[21]证实GC患者血清cfDNA水平高于健康对照组，且用于诊断GC患者的敏感性为96.67%，特异性为94.11%。这些研究提示ctDNA可作为胃癌诊断的肿瘤标志物。Newman[22]等也在非小细胞肺癌的研究中证实了这一价值，他们用MPS的方法检测非小细胞肺癌ctDNA中的突变体，其特异性为96%。值得注意的是，目前ctDNA检测对早期癌症的敏感性约为30%～40%[23]。因此，大多数I期和II期癌症将不会被当前的ctDNA分析方法所检测到。

3.2 CTCs和ctDNA在胃癌的预后评估及疗效监测方面的价值 对于进展期GC，尽管某些靶向治疗和免疫抑制治疗等方法具有很好的效果，但其预后仍然很差，即使是早期胃癌在治疗后也会有20%-50%的几率复发[24]。因此，可靠的预后因素对于确定有最大复发风险的患者和需要特殊监测或治疗的侵袭性疾病患者具有重要作用。

在胃癌的相关研究中，CTCs的检出预示着胃癌患者具有更短的无进展生存期和总生存期[25]。Uenosono等[26]使用CellSearch系统检测了 251名GC患者的CTCss，结果表明CTCs阳性患者的无复发生存率和5年生存率显著低于CTCs阴性患者。Wang等人[27]发现CTCs阳性的GC患者较CTCs阴性的GC患者复发率高，3年无病生存期短。一项meta分析显示，CTCs在晚期GC中比早期GC更常见，在分化差的GC中比分化好或中等分化的GC更常见，并且与患者的无进展生存期和总生存期显著相关[28]。这些研究提示了CTCs可以作为监测胃癌患者复发或预后的有效指标。在日本，根据胃癌辅助化疗试验(ACTS-GC)的数据显示，几乎所有接受胃切除术后的患有II期或III期肿瘤的患者均接受辅助化疗[29]，然而，在没有辅助化疗的情况下，该阶段约60%的患者没有复发。如果可以预测术后复发，那么有关CTCs的信息就可以帮助患者避免不必要的辅助化疗。目前，一些研究已经提示了CTCs检测在胃癌化疗期间的预测价值。Li[30]等在15名AGC患者的治疗期间监测CTCss的动态变化，结果表明治疗后有着持续低水平CTCss的患者或早期转变为低水平CTCss的患者预后较好；而具有持续较高水平CTCss的患者或在治疗后转变为较高水平CTCss的患者预后较差，这意味着对所施用的治疗效果有限。Zou等[31]的一项meta分析得出CTCs的状态对单独化疗的胃癌患者有着显著的预后价值。因此，评估CTCs可能是预测GC患者肿瘤预后和疗效监测的有效策略。

目前，需要连续的检测来监测癌症的进展。对于传统的组织活检来说，多次重复取样通常是困难的，并且并非所有患者都能在疾病进展时进行组织活检。而ctDNA因其能够对肿瘤患者实现实时监测而备受关注。Yunhe Gao[20]等研究表明，ctDNA检出的患者相对于未检出的患者，PFS和OS明显缩短，ctDNA的存在还与胃癌的TNM分期显著相关。另一项研究表明，对于接受GC治疗性手术的患者，ctDNA水平与肿瘤复发有关[21]。Garcia-Murillas[32]等在评估ctDNA作为乳腺癌术后复发的潜在预测因子研究中发现，80%的癌症复发患者可以通过数字PCR和MPS检测到ctDNA，平均约提前临床复发7个月，而在没有复发的患者中，96%没有检出ctDNA。这些数据提示血液ctDNA分析可以为癌症的预后及进展提供评估。ctDNA的另一个临床潜力是确定化疗方案、预测化疗反应以及确定耐药机制。与放射成像或肿瘤标志物相比，ctDNA半衰期短的特点能够较好的用于癌症的实时监测。一项对53名转移性胃肠道肿瘤患者的前瞻性研究表明，一线化疗期间ctDNA的早期变化预示着后来的影像结果。ctDNA水平在第二周期前显著降低，并与8～10周的CT结果相关[33]。基于血液的监测是癌症治疗中的理想策略，因为它具有较小的侵袭性和能避免辐射暴露。且常规组织活检获得的遗传信息可能不能提供整个癌症基因组的完整特性，而癌症基因组的不完全基因分型可能会导致患者诊断不准确并阻碍其有效治疗。研究显示，ctDNA分析，特别是基于MPS的分析，在描述癌症的空间和时间异质性上比传统组织活检更具优势[34]。相关研究已经报道，AGC的高肿瘤内异质性会导致IHC和FISH之间或内窥镜活检和切除的肿瘤标本之间的结果不一致，克服这个问题的一个备选方案就是用ctDNA进行分析[35]。Gao J[36]等用NGS分析了70例胃癌患者血浆ctDNA中her2的扩增情况，结果与组织中IHC/FISH的总符合率为91.43%。70例患者中，仅4例ctDNA检出her2阳性，其中1例接受曲妥珠单抗治疗，病情稳定。这表明对于检测her2的扩增情况，血浆ctDNA与组织活检有较高的一致性。

4 展望

综上所述，基于CTCs、ctDNA血液肿瘤标记物的液态活检具有微创性、易获得性和可重复性等优势，且对胃癌的诊断、疗效监测及预后评估具有重要意义，但由于这些生物标记物在血液中的浓度较低，缺乏灵敏度较好的检测方法，且在技术方法上缺乏共识，没有普遍接受的“金标准”，使各实验室间检测的灵敏度和特异性等相关性能差别较大，不能很好的对检测结果进行对比分析，这使得CTCs及ctDNA应用于常规临床试验的工作受到阻碍。因此，必须在临床试验中验证更好的检测方法，尽量减少假阴性和假阳性等问题的发生，以便早日实现临床的有效性和实用性。