不同杂交桑品种桑叶活性物质含量的测定及药用品质综合评价

赵东晓 李公存 董亚茹 耿兵 陈传杰 王照红 娄齐年 孙景诗

摘要：为筛选适合食药用杂交桑品种，测定了5个杂交桑品种的桑叶1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin， DNJ）、总黄酮、多糖、总多酚和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）含量，并用隶属函数法对桑叶的药用品质进行综合评价。结果表明，不同品种杂交桑桑叶DNJ、总黄酮、多糖、总多酚和GABA含量存在较大差异，5个杂交桑品种药用品质从高到低依次为丰驰、秦桑、浙桑3号、浙桑1号、鲁桑1号。

关键词：杂交桑;桑叶;活性物质;药用品质;综合评价

中图分类号：S548.01 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）12-0100-06

Abstract In order to select mulberry hybrids suitable for food and medicine， the contents of 1-deoxynojirimycin （DNJ）， total flavonoids， polysaccharides， total polyphenols and γ-aminobutyric acid （GABA） in leaves of five mulberry hybrids were determined， and the medicinal quality were comprehensively evaluated by membership function method. The results showed that there were significant differences in DNJ， total flavonoids， polysaccharides， total polyphenols and GABA contents between different hybrids. According to the comprehensive analysis by membership function method， the medicinal quality of the five mulberry hybrids from high to low was Fengchi， Qinsang， Zhesang 3， Zhesang 1 and Lusang 1， respectively.

Keywords Mulberry hybrid;Mulberry leaves;Active substances;Medicinal quality;Comprehensive evaluation

桑树是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）多年生木本植物。桑叶既是家蚕唯一天然食物，又是一种传统中药材。桑叶含有丰富的营养生物活性物质，如黄酮类、多糖类、生物碱类、植物甾醇、多种维生素及矿物质等[1]，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、提高人体免疫力等功能[2-4]。此外，桑叶蛋白质含量高，可用作饲料加工，具有消化率高、适口性好等特点[5]。桑叶有抗炎、抑菌的优点，可作为新型饲料添加剂，为无抗饲料的加工提供新思路[6]。

目前业内认为杂交桑叶片薄、叶质差，但杂交桑具有生长快、产叶量大，适宜机械化收割、牲畜适口性好等优点[7]，是饲料的理想材料。杂交桑作为饲料桑的开发利用成为近年来蚕桑产业多元化发展的重要方向之一。筛选高药用品质的杂交桑品种对杂交桑无抗饲料开发利用有重要意义。本研究对收集的5个杂交桑叶片中1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin， DNJ）、总黄酮、多糖、总多酚和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， GABA）含量进行检测和综合分析，旨在为杂交桑叶利用和高品质饲料桑开发提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料和主要试剂

供试材料为一年生杂交桑第5～8叶位的成熟叶片，品系分别为丰驰、秦桑、鲁桑1号、浙桑1号、浙桑3号。桑叶于2019年7月中旬采摘于山东省蚕业研究所南院试验场桑园。采摘时间为上午9∶00，采摘后的桑叶用自来水清洗干净后，用蒸馏水冲洗3遍，置于50℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛，分装于密封袋中，-40℃保存备用。

DNJ 标准品、芦丁标准品、没食子酸标准品、葡萄糖标准品、γ-氨基丁酸（GABA）标准品、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl） 、乙腈（色谱纯），均为 Sigma 公司产品。甘氨酸、浓盐酸、氢氧化钠、乙醇、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、亚硫酸氢钠、乙酸锌、冰乙酸、亚铁氰化钾、碘、碘化钾、浓硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、福林酚试剂、碳酸钠、氯化铝、氢氧化钾、十水合四硼酸钠、安替福民均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 桑叶DNJ的提取及含量检测 按照文献[8]的方法。

DNJ标准曲线制作：精确称取DNJ标准品10 mg，用去离子水配置的0.05 mol/L HCl溶液溶解并定容至10 mL，得到浓度为1 mg/mL的DNJ标准品溶液，-40℃保存备用。精确吸取DNJ标准品溶液0、2、4、6、8、10、12、20 μL于5 mL离心管中，分别加入一定量的0.05 mol/L HCl溶液稀釋至100 μL。加入pH=8.5、0.4 mol/L硼酸盐缓冲液100 μL，再加入浓度为5 mmol/L的FMOC-Cl/乙腈溶液200 μL，充分混匀，20℃反应20 min，再加入1 mol/L甘氨酸溶液100 μL终止反应;加入0.1%的冰醋酸溶液100 μL稳定生成的衍生物，混匀后加入去离子水500 μL。经0.22 μm滤膜过滤，滤液采用高效液相色谱（HPLC）法检测分析。检测条件为：反向色谱柱C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流动相为乙腈-0.1%冰醋酸（体积比45∶55），流速1 mL/min，柱温28℃，荧光检测器波长254 nm，进样量20 μL，停止时间30 min。以DNJ标准品溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

准确称取桑叶粉0.2 g，加入0.05 mol/L HCl溶液定容至10 mL，涡旋30 s后超声提取30 min，12 000 r/min 离心15 min，上清液即为DNJ 提取液。取DNJ提取液100 μL，按照DNJ标准曲线制作方法进行衍生化处理和色谱检测，参照标准曲线，计算桑叶DNJ含量。

1.2.2 桑叶总黄酮的提取及含量检测 按照文献[9]的方法。

总黄酮标准曲线制作：准确称取芦丁标准品10 mg于50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得到浓度为0.2 mg/mL芦丁对照品溶液，-40℃保存备用。精确吸取芦丁对照品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于5 mL离心管中，再分别加入一定量的70%乙醇溶液稀释至1.00 mL。加入质量分数5%的 NaNO2 60 μL，摇匀后静置6 min，加入10%Al（NO3）3 60 μL，混匀后静置6 min，再加入4%的NaOH溶液800 μL，用70%乙醇稀释至2 mL，摇匀后静置10 min。测定各管510 nm吸光值，以同样处理的0 mL芦丁对照品溶液进行空白校正，制作标准曲线。

准确称取桑叶粉0.5 g，加入70%乙醇定容至50 mL，超声提取20 min后，60℃水浴3 h，过滤并收集滤液。4℃静置过夜，上层液即为待检测液。取200 μL待测液，加入70%乙醇800 μL稀释后，按照制作标准曲线方法测定各样品510 nm吸光值，参照标准曲线，计算桑叶总黄酮的含量。

1.2.3 桑叶多糖的提取及含量检测 按照文献[10]的方法。

多糖标准曲线制作：精确配制1.056 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别吸取0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64 mL葡萄糖对照品溶液，加至10 mL具塞比色管中，以0 mL葡萄糖标准品溶液作为空白对照，加蒸馏水稀释至0.80 mL。分别加入60 μL DNS试剂，摇匀，沸水浴5 min后立即置于冰水中冷却，用蒸馏水定容至10 mL，测定各管540 nm吸光值。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

提取5个杂交桑品种桑叶水溶性糖和总糖，按照制作标准曲线的方法测定540 nm吸光值，分别计算各品种桑叶水溶性糖和总糖含量。多糖含量=（总糖含量-水溶性糖含量）×0.9×100%。

1.2.4 桑叶总多酚的提取及含量检测 按照文献[11]的方法。

总多酚标准曲线制作：准确称取没食子酸标准品20 mg于200 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到浓度为0.1 mg/mL没食子酸对照品溶液，-40℃保存备用。精确吸取没食子酸对照品溶液0、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mL于5 mL离心管中，再分别加入一定量的蒸馏水稀释至1.00 mL。各管中加入1 mL 福林酚试剂，混匀后静置10 min，然后加入10% Na2CO3 溶液2 mL，混匀后25℃遮光反应1 h 显色。测定各管765 nm吸光值，以同样处理的0 mL没食子酸对照品溶液进行空白校正，制作标准曲线。

准确称取桑叶粉0.5 g，加入pH=4.0 的70%乙醇并定容至50 mL，超声提取30 min后，60℃水浴90 min，冷却后12 000 r/min离心10 min，上清即为桑叶总多酚提取液。取25 μL提取液，加入pH =4.0 的70%乙醇950 μL稀释，按照总多酚标准曲线测定方法检测各样品765 nm吸光值，参照标准曲线，计算桑叶总多酚的含量。

1.2.5 桑叶GABA提取及含量检测 按照文献[12]的方法。

GABA标准曲线制作：准确称取GABA标准品10 mg，用蒸馏水溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL GABA对照品母液，-40℃保存备用。精确吸取GABA对照品溶液0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1.000 mL，加蒸馏水稀释至1.000 mL，加入2 mol/L AlCl3溶液50 μL，充分摇匀后振荡10 min，12 000 r/min离心 5 min，取500 μL上清液，加入浓度为1 mol/L 的KOH溶液300 μL，振荡5 min后12 000r/min离心5 min。取300 μL上清液，依次加入pH=10.0的0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液500 μL、6%苯酚400 μL、50 g/L NaClO 溶液600 μL，每一步均充分混匀。沸水浴中加热10 min后置于冰水浴5 min，待溶液出现蓝绿色后，加入60%乙醇2.0 mL，测定645 nm吸光值。以GABA质量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

准确称取0.05 g桑叶粉于离心管中，加入100%甲醇2 mL，振荡 15 min后5 000 r/min离心15 min，弃上清液。重复2次上述操作。将离心后收集的沉淀物烘干后加蒸馏水2 mL，超声波提取20 min后，50℃水浴中提取2 h，5 000 r/min离心15 min，上清即为桑叶GABA提取液。吸取1 mL提取液，按照GABA標准曲线制作方法，测定各样品645 nm吸光值。参照标准曲线，计算桑叶GABA的含量。

1.2.6 桑叶药用品质综合评价 参照文献[13]中的方法，借助隶属函数，分别将桑叶DNJ、总黄酮、多糖、总多酚和GABA含量测定值标准化，计算各指标的隶属函数值，公式为：X（i）= （Xi-Ximax）/（Ximin-Ximax）。式中，X（i）表示桑叶药用品质综合评价中第i类成分的隶属函数值，Xi表示桑叶第i类药用成分含量实际测定值，Ximin和 Ximax分别表示桑叶第i类药用成分含量中的最小测定值和最大测定值。对桑叶DNJ、总黄酮、总多酚、多糖和GABA隶属函数值累加求和，将其作为杂交桑叶药用品质综合评价得分。

1.3 数据处理与分析

用Microsoft Excel 2007和SPSS 20软件对试验数据进行处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同桑品种桑叶中的DNJ含量比较

如图1所示，5个杂交桑品种桑叶中的DNJ含量在0.23～0.50 mg/g之间。其中，丰驰含量最高（0.50 mg/g），极显著高于其它品种。其次为鲁桑1号（0.34 mg/g）、浙桑3号（0.33 mg/g）、浙桑1号（0.29 mg/g）。秦桑含量最低（0.23 mg/g），是丰驰的46.00%。

2.2 不同桑品种桑叶中的总黄酮含量比较

如图2所示，5个杂交桑品种桑叶中的总黄酮含量差异较大。其中丰驰含量最高，为4.74 mg/g，极显著高于其它品种。其次为秦桑，含量为3.73 mg/g，比丰驰低21.32%。再次为鲁桑1号，含量为3.21 mg/g，比丰驰低32.33%。浙桑1号含量为3.17 mg/g，比丰驰低33.24%。浙桑3号含量最低，仅为3.05 mg/g，比丰驰低35.76%。

2.3 不同桑品种桑叶中的多糖含量比较

如图3所示，5个杂交桑品种桑叶中的多糖含量由高到低依次为丰驰、秦桑、浙桑1號、浙桑3号和鲁桑1号，多糖含量依次为16.10、15.93、15.86、15.55 mg/g和14.31 mg/g。其中鲁桑1号多糖含量极显著低于丰驰、秦桑、浙桑1号和浙桑3号。

2.4 不同桑品种桑叶中的总多酚含量比较

如图4所示，5个杂交桑品种桑叶中的总多酚含量在15.18～22.67 mg/g。由高到低依次为丰驰、秦桑、鲁桑1号、浙桑1号和浙桑3号，其中丰驰总多酚含量为22.67 mg/g，极显著高于其它品种。

2.5 不同桑品种桑叶中的GABA含量比较

如图5所示，5个杂交桑品种桑叶中的GABA含量在3.67～4.16 mg/g。浙桑3号、秦桑、浙桑1号、鲁桑1号和丰驰GABA含量依次为4.16、4.14、3.93、3.85 mg/g和3.67 mg/g。各品种间桑叶GABA含量差异不显著。

2.6 桑叶药用品质综合评价得分比较

将桑叶DNJ、总黄酮、多糖、总多酚和GABA 5种生物活性物质作为杂交桑药用品质的评价指标，用模糊数学的隶属函数平均值大小表示其相对优劣，计算隶属函数平均值，并对其药用品质优劣进行综合排序，隶属平均值越大，表明该品种药用品质越高。由表1可见，5个杂交桑品种药用品质从高到低依次为丰驰、秦桑、浙桑3号、浙桑1号、鲁桑1号。

3 讨论与结论

DNJ是首次从桑树中分离得到的一种生物碱，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，从而有降血糖的作用，能有效预防和治疗Ⅱ型糖尿病[14]。越来越多的研究发现，DNJ存在于多种微生物[15，16]和植物[17，18]中，而桑树是目前发现的DNJ含量最高的植物[1]。本研究检测的5个杂交桑品种叶片DNJ含量存在极显著差异，含量在0.23～0.50 mg/g之间，与张俊[1]、曾卫湘[10]等的研究结果相比偏低。

黄酮是一类植物次生代谢产物，目前研究认为生物和非生物胁迫可刺激植物产生黄酮类物质[19]。桑叶黄酮具有清除自由基、抗菌、抗癌、抗病毒、降血糖、降血脂等功效[20]。本研究检测的5个杂交品种桑叶总黄酮含量在3.05～4.74 mg/g之间，存在极显著差异，与敬成俊等[12]的研究结果相符。

多糖是桑叶中的主要活性物质之一，具有显著的降血糖血脂、抗氧化、调节免疫力等功能[10]。目前研究认为桑叶多糖含量与品种、产地、气候、处理方式有显著的相关性[21]。本研究检测的5个杂交桑品种叶片多糖含量在14.31～16.10 mg/g之间，存在极显著差异，与曾卫湘等[10]的研究结果相比偏低，与敬成俊等[12]的研究结果相符。

多酚是一种植物酚类次生代谢产物，广泛存在于植物的叶片、根、皮、果实等部位。桑叶总多酚具有抗辐射、抗衰老、抗氧化、防治肿瘤、增强机体免疫力、治疗脂肪肝等功能[22]。本研究检测的5个杂交品种桑叶总多酚含量在15.18～22.67 mg/g之间，存在极显著差异，与敬成俊等[12]的研究结果相比偏高，与沈维治等[22]的研究结果相符。

GABA是广泛存在于植物体中的一种非蛋白质氨基酸类天然活性成分，对人体的神经系统发育具有重要调节作用，有抗焦虑、降血压等作用[23]，对植物有增强逆境胁迫的功能[24]。桑树是一种GABA含量较高的植物。本研究检测的5个杂交桑品种叶片GABA含量在3.67～4.16 mg/g之间，差异不显著，与冀宪领等[23]研究结果相比偏高、与王瑞娴等[25]的研究结果相符。

本研究中杂交桑叶生物活性成分含量与以往研究有所不同，一方面可能与供试杂交桑品种本身遗传背景和生理特性有关;另一方面，不同气候因素和栽培条件，如光照、温度、湿度、降雨量和土壤类型等对植物次生代谢产物含量也会产生一定的影响[19，26]。

本研究供试的5个杂交桑品种中，丰驰是桑叶DNJ、总黄酮、多糖、总多酚含量最高的优势品种，浙桑3号是GABA含量最高的优势品种。通过隶属函数法将5个品种桑叶DNJ、总黄酮、多糖、总多酚和GABA含量标准化，以5种药用成分隶属函数平均值对各品种桑叶药用品质进行综合评价，结果表明5个杂交桑品种药用品质最高的为丰驰，可作为食药专用杂交桑品种的候选。本研究为药食专用杂交桑品种的选育提供了科学依据。

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