利用条件反射箱检测血管性认知障碍大鼠的执行功能

杨宇琦，杨凌宇，吴晓莉，厉含之，陈予东，刘丽旭

(中国康复研究中心神经康复科，北京 100068)

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment,VCI)包括与脑血管疾病相关或由脑血管疾病引起的轻至重度认知障碍，是脑血管病常见的并发症[1]。随着人口老龄化的进展，VCI逐渐加重家庭及社会的负担。人口老龄化和老年人群中VCI的高发病率都将导致未来30年VCI患者数量将大幅增长[2]。既往研究强调认知功能障碍可能是脑血管病最早、最常见、最敏感的表现，并提出认知功能障碍可作为一种预后指标[3]。事实上，早期发现细微的认知减退并不容易，VCI在治疗过程中不能停止或逆转认知功能障碍，只能在减缓认知衰退进程的较晚阶段被发现[4]。因此，本研究采用前期课题组发明的操作性条件反射箱对大鼠进行电击刺激建立动物伤害性刺激的操作性条件反射，观察VCI大鼠的行为学特征，同时通过观察脑组织的超微结构，研究操作性条件反射箱对评估VCI大鼠执行功能的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

条件反射箱(专利号：ZL 200910084240.3，张通教授设计，上海吉量公司制造)：箱体外壁长×宽×高=37 cm×27 cm×45 cm，内壁长×宽×高=35 cm×25 cm×40 cm，箱体壁厚1 cm(铜棒中心到顶板/摄像头的高度为32 cm)；DigBehv 动物行为分析系统(上海吉量软件公司)；Morris水迷宫仪(上海吉量公司)。成年Sprague-Dawley 大鼠(n=50,雌雄各半，体重260～280 g)购自中国军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK-(军)2002-001。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物建立反射及分组 50只SD大鼠饲养于清洁级动物房内，室温22～26 ℃，标准12 h光/暗循环昼夜交替，固定饲料喂养，自由饮食。观察动物精神活泼、反应灵敏、体形正常、毛色光泽者可纳入实验。将大鼠放入条件反射箱中，熟悉环境1 min，1 min后箱底通电，反射箱底通电后，设定电压为35 V，刺激时间为10 min。观察到大鼠自发畏缩、竖毛、举尾、并随电压增加出现跳跃甚至嘶叫等，在箱内无目地跑动，会多次无意踩踏板装置而中断电流解除电流刺激，反复多次后，大鼠学习到如何避免伤害性刺激。以压操纵杆时间超过刺激时间的90%为建立反射成功。对大鼠进行持续4 d的条件反射，在操作中尽量保证大鼠不受到惊吓与注意力的转移。最后，选取建立操作性条件反射成功大鼠45只，随机分为模型组15只，假手术组15只，空白对照组15只。

1.2.2 实验动物大脑中动脉缺血再灌注损伤模型制备 采用线栓法对模型组进行大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)缺血再灌注手术，该模型均对左侧进行栓塞，以大鼠出现呼吸、心跳加快，甚至出现尿失禁，即为MCA起始处栓塞成功[5]。栓塞后缝合，缺血2 h拉出线栓灌注。假手术组同上，但栓线只到颈外动脉和颈内动脉的分叉处。术后观察大鼠行为变化，无异常后继续饲养,自由饮食。

1.2.3 实验动物执行功能测定 将手术干预后的3组实验动物在术后48 h放入条件反射箱，施以35 V电压和10 min刺激时间的电击，观察压杆的时间、活动的轨迹和路程，并通过视频观察活动情况。

1.2.4 实验动物Morris水迷宫检测 对各组大鼠进行Morris水迷宫检测，观察各组大鼠的行为学改变，通过空间探索试验和定位航行试验来进行[6]。训练共6 d，上午及下午各训练4次，定位航行试验中观察大鼠2 min内找到平台的时间，记录逃避潜伏期，定位航行试验结束后撤除平台，进行空间探索试验。任选一个相同入水点将各组大鼠分别放入水中，在2 min内观察并记录大鼠跨越原平台象限的次数。比较各组大鼠的逃避潜伏期和跨越次数，若模型组与其他两组之间存在差异，则提示该模型造模成功[7]。

1.2.5 观察各组大鼠感觉运动皮层的超微结构 参照Woolsey的新皮层机能分区法和神经系统解剖图取左侧运动感觉皮层处直径1 mm的组织块制作电镜标本：2%多聚甲醛、2%戊二醛溶液中固定2 h，经0.l mol磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗，再经1%四氧化锇酸固定2 h，磷酸盐缓冲液冲洗3次，梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，制备超薄切片，经醋酸双氧-枸橼酸铅染色。每份标本制作3张铜网。PhihPsCMor透射电镜(首都医科大学神经科学研究所)检测标本，观察运动感觉皮层的神经病理变化，AGFA数码相机拍照，定性分析标本病理学变化。

1.3 统计学分析

用SPSS 25.0统计软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫检测结果

假手术组与对照组的平均逃避潜伏期、跨越次数比较，差异无统计学意义(t=1.944、0.346，P=0.062、0.732)。模型组的平均逃避潜伏期均大于假手术组和对照组(t=28.488、22.490，P<0.001)，而平均跨越次数均少于假手术组和对照组(t=15.255、9.475,P<0.001)，提示该模型造模成功。见表1。

2.2 各组大鼠在操作性条件反射箱中的测试结果

在反射箱中，假手术组与对照组的平均压杆时间、路程相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组的压杆时间均低于假手术组和对照组，而活动路程参数均高于假手术组和对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期、跨越次数的检测结果

*P<0.001，与假手术组比较；#P<0.001，与对照组比较。

表2 各组大鼠操作性条件反射箱测试结果

*P<0.001，与假手术组比较；#P<0.001，与对照组比较。

2.3 大鼠脑组织超微结构的变化

经电镜观察发现，模型组运动感觉皮层发生了神经细胞固缩、破裂，胞核固缩移位，新生突触形成，髓鞘疏松等一系列病理变化，而假手术组及对照组则无上述变化。见图1。

3 讨论

绝大多数急性脑卒中病例是因供血动脉血管闭塞引起的，而由血管破裂伴相关出血引起的急性脑卒中只占少数，约15%。局灶性脑缺血所导致的脑损伤的程度取决于许多因素，例如缺血的严重程度、持续时间或者重要的侧支血流量[8]。VCI发病率逐年上升，然而它的发病机制尚不明确，临床治疗上仍缺乏明确、高效的药物和治疗方法。因此，VCI 动物模型的有效建立和认知功能的成功检测对研究VCI的发病机制、药物治疗有着重要意义。目前，啮齿类动物在VCI模型中应用最为广泛，本研究选用了近年来国内外常用的一种大脑中动脉缺血再灌注损伤法来制作VCI 动物模型[9-10]。同时，采用已有30多年研究历史的Morris水迷宫来客观评价VCI动物的学习记忆功能，该方法是研究动物海马损害后的空间学习记忆能力变化的行为学方法，也是评价VCI动物模型认知功能障碍的最重要行为学方法[11-12]。

Morris水迷宫主要检测的是记忆力及空间学习能力，通过行为学改变来体现。然而，水迷宫缺乏对执行功能的检测，对实验室的条件和实验动物的体力要求比较高，老年大鼠及造模手术后大鼠完成检测较困难。因此，本研究应用Morris水迷宫检测VCI大鼠造模成功，模型组的平均逃避潜伏期均大于假手术组和对照组，而平均跨越次数均少于假手术组和对照组(P<0.05)。采用前期课题组发明的能使大鼠形成稳定条件反射且能检测局灶性缺血大鼠浅感觉障碍的操作性条件反射箱来检测VCI大鼠的执行功能，结果发现，模型组在反射箱中的压杆时间均低于假手术组和对照组，而活动路程参数均高于假手术组和对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示该试验装置能够检测VCI大鼠的执行功能。

以往大量研究[13-14]表明，有关VCI的主要致病机制包括了炎症、氧化应激、突触结构和功能异常、中枢胆碱能及单胺能系统神经递质功能紊乱、能量代谢障碍等，同时也描述了缺血再灌注后脑组织的形态学变化。然而，目前针对脑内超微结构的研究及观察鲜有报道，本研究通过透射电子显微镜发现模型组运动感觉皮层的一系列病理变化，如：神经细胞固缩、破裂，胞核固缩移位，新生突触形成，髓鞘疏松等，而假手术组及对照组则无上述变化，这些发现在一定程度上也验证了行为学检测的结果。总之，本研究发现操作性条件反射箱能评估VCI大鼠的执行功能，为VCI的早期发现和治疗提供一定的理论依据。