Nrf2基因多态性与高原地区藏族人群POAG易感性的关系

张福香,辛晓蓉

(1西宁市第三人民医院眼科,西宁 810000;2青海红十字医院眼科)

原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)是常见的青光眼类型,占所有青光眼的60%-70%,是全世界第二常见的致盲原因,其特征是视网膜神经节细胞轴突的进行性变形,但其发生机制尚不清楚,多认为由环境因素与基因共同作用引起[1-3]。研究证实一些基因位点有助于POAG的易感性的判定[4,5]。研究显示,氧化应激的变化与POAG患者眼压变化有关[6],而核相关因子2(nuclear correlation factor 2,Nrf2)是近年来发现的对氧化应激极为敏感的基因转录因子,是细胞抗氧化应激的枢纽,其中rs10497511、rs1962142、rs2364722、rs6721961位点单核苷酸多态性与氧化应激密切相关[7],本研究猜测Nrf2可能通过影响氧化应激影响POAG发生,然而Nrf2基因多态性在POAG中作用国内暂未见文献报道。因此本研究以中国高原地区藏族人群为研究对象,探讨Nrf2基因rs10497511、rs1962142、rs2364722、rs6721961位点单核苷酸多态性与POAG易感性的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究采取回顾性分析,收集2016-06～2018-08青海地区本院确诊的POAG患者97例患者的病例资料作为POAG组,其中男56例,女41例;年龄18-39岁,平均年龄(25.37±3.18)岁;平均病程(3.25±0.68)年。纳入标准:藏族;年龄≥18岁;高眼压下通过房角镜检查可观察到房角处于开放状态;1 d内眼压超过21 mmHg≥2次,且1 d内眼压波动≥6 mmHg;眼底检查:垂直杯盘比≥0.7或双眼杯盘比差值>0.2,并出现不同程度视盘改变;视野检查发现不同程度的青光眼性视野缺损;光学相干断层扫描检测发现视神经纤维层损坏。另选取同期体检健康者103例作为对照组,均为藏族,其中男59例,女44例,年龄18-39岁,平均年龄(26.17±3.53)岁,无POAG家族史、其他类型眼部疾病及其他相关遗传性疾病。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经西宁市第三人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 收集两组所有研究对象抗凝血液标本,保存在-80 ℃的冰箱中,常规解冻后采用血液基因组DNA快速抽提试剂盒提取外周血基因组DNA,严格按照操作说明书进行。

1.2.2 聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性方法(PCR-RELP)检测Nrf2基因多态性 根据Gen bank公布的序列,利用Primer 5.0生物软件设计各Nrf2基因多态性位点的引物,进行PCR反应,PCR反应体系:高保真Taq酶1 μl,上、下游引物(25 μmol/L)各1 μl,10×Tap Buffer 1 μl,4×dNTP(2.5 mmol/L)1 μl,DNA模板1 μl,ddH2O 14 μl,单管反应体积20 μl。PCR反应条件:先94 ℃预变性5 min,然后94 ℃变性、30 s,60 ℃退火45 s、72 ℃延伸45 s,以上3个步骤循环35次,最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取出离心备用,对产物进行纯化。采用限制性内切酶MspⅠ(大连宝生物工程公司)酶切鉴定。酶切反应体系:10×Buffer 1.5 μl, 0.1×BSA 1.5 μl,MspⅠ 0.8 μl, PCR产物DNA 6 μl,ddH2O 5.2 μl。单管反应体积15 μl。反应条件:37 ℃下温浴2 h,10×Buffer 1.5 μl终止反应。酶切产物以3.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色分析。产物委托北京天根生化科技有限公司代为测序,引物序列见表1。

表1 基因多态性位点引物设计Table 1 Primer design of gene polymorphism site

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料比较

对照组与POAG组间性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、SBP、DBP、SaO2表达差异均无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.2 HWE平衡试验

根据Hardy-Weinberg平衡定律,对照组与POAG组各基因型的期望值和观察值符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05,见表3),提示群体来自同一孟德尔群体,所选样本进行群体遗传学研究具有代表性。

2.3 Nrf2基因多态性位点基因型及等位基因分布情况

POAG患者与正常人基因多态性位点rs10497511、rs2364722、rs6721961基因型及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组人口学及生理参数比较Table 2 Comparison of demographic and physiological parameters between the two groups

表3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果Table 3 Hardy-Weinberg genetic balance test results

aa分别表示各位点野生型CC，TT，GG，AA;ab表示CT，TC，GA，TG;bb表示TT，CC，AA，GG

103例对照组基因多态性位点rs1962142三种基因型分别为:TT型98例(95.1%),TC型5例(4.9%),CC型0例(0.0%),T等位基因频率为97.6%,C等位基因频率为2.4%。

97例POAG组患者基因多态性位点rs1962142三种基因型分别为:TT型53例(54.6%),TC型37例(38.1%),CC型7例(7.2%),T等位基因频率为73.7%,C等位基因频率为26.3%。

两组rs1962142位点基因型、等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,POAG组患者TT基因型频率显著降低(P<0.05),TC、CC基因型频率显著升高(P<0.05).T等位基因频率显著下降(P<0.05),C等位基因频率显著升高(P<0.05,见表4)。

表4 Nrf2基因多态性位点基因型及等位基因分布情况 例(%)Table 4 Genotype and allele distribution of Nrf2 gene polymorphism site cases(%)

2.4 基因SNPs位点基因型分布与POAG的关系

以是否发生POAG为自变量,基因多态性位点基因分型为因变量进行二元logistic回归分析,显示rs1962142位点TC、CC型是发生POAG的危险因素(OR=2.726,2.298,均P<0.05,见表5)。

表5 Nrf2基因多态性位点基因型与POAG遗传易感性关系Table 5 Relationship between Nrf2 gene polymorphism and POAG genetic susceptibility

aa分别表示各位点野生型CC，TT，GG，AA;ab表示CT，TC，GA，TG;bb表示TT，CC，AA，GG

3 讨论

POAG发病机制尚不完全清楚,一般认为是环境与基因共同作用的结果,由于POAG发病较为隐蔽,且对其早期诊断又缺乏特异性,患者就诊时视功能已严重损伤,即使采取了联合用药或者手术治疗,仍不能有效控制眼压、延缓视神经萎缩,或者虽然控制眼压在正常范围,但视神经损伤仍缓慢进展[8,9]。因此POAG早期诊断和治疗可以最大限度地保存现有视力及延缓青光眼病程的进展。

氧化应激在POAG患者小梁网细胞损伤中发挥重要作用,POAG患者房水的抗氧化能力较正常人弱,氧化自由基和活性氧影响人小梁网细胞结构与功能,使房水流出阻力增加[10,11]。动物实验研究也发现氧化应激反应是影响高眼压模型大鼠眼压增高的原因之一[12]。Nrf2属于亮氨酸拉链转录激活因子家族,有一高度保守的碱基亮氨酸拉链结构,在各种细胞普遍表达,对氧化应激十分敏感[13]。生理状态下,Nrf2与胞浆中的Keap1蛋白结合以抑制自身活性,当受到氧自由基或亲电试剂刺激后,Nrf2磷酸化并与Keap1蛋白解偶联,以活性状态进入细胞核,识别并与抗氧化反应元件结合,诱导下游抗氧化蛋白基因的表达,清除自由基,还原过氧化物[14]。耿倩雯等[7]研究表明,Nrf2单核苷酸多态性与急性高原病密切相关,而急性高原病主要是由于低氧高压造成的,与POAG的发病机制有一定类似性[15]。本研究中,对照组与POAG组Nrf2位点均符合哈登平衡定律,提示本研究样本来自同一孟德尔群体,所选样本进行群体遗传学研究具有代表性。

本研究中,Nrf2基因位点s10497511、rs2364722、rs6721961基因型及等位基因频率在对照组与POAG组中比较差异无统计学意义,而rs1962142位点中与对照组比较,POAG组患者TT基因型频率显著降低(P<0.05),TC、CC基因型频率显著升高(P<0.05),T等位基因频率显著下降(P<0.05),C等位基因频率显著升高(P<0.05),提示Nrf2基因位点rs1962142中T-C突变可能是POAG发病的易感因素,猜测原因可能为位点rs1962142中T-C突变阻碍Nrf2转录发挥抗氧化作用,在低温高氧刺激下眼压增高,易发生POAG,虽无研究证实Nrf2基因多态性与POAG发生的确切研究,但研究显示Nrf2激活引起的氧化应激在青光眼的发生过程中发挥作用。Logistic回归分析结果表明,Nrf2基因多态性位点rs1962142 TC、CC基因型频率升高是POAG疾病发生的危险因素,进一步提示,Nrf2基因多态性位点rs1962142 T-C突变可能是高原地区藏族人群POAG患者遗传易感基因。

综上所述,Nrf2基因多态性位点rs1962142基因多态性与高原地区藏族人群POAG遗传易感性有关。本研究也存在一定不足,样本选择受地区、样本量的限制,需进一步扩大地区、样本证实Nrf2基因多态性与POAG易感性关系。