无创诊断和评估非酒精性脂肪性肝炎研究进展*

谢晓综述，陆伦根审校

近年来，非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）逐渐成为全球最常见的慢性肝病，并成为重要的公共卫生问题。NAFLD是指除外过量饮酒或其他因素导致脂肪在肝脏聚积，影像学或肝组织病理学证实脂肪变的临床病例综合征，主要包括单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL），非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），相关肝硬化及肝细胞癌[1]。在亚洲，NAFLD 的患病率为15%～20%，每年发病率为3%～5%，我国NAFLD的患病率为6%～38%，平均20%[2]。NAFL一般为良性病变，且发展较为缓慢，但大约20%的NASH患者在10年内可能发展为肝硬化，8%的NASH患者将会死亡，且NASH是目前导致肝移植及肝细胞癌发生的第二位最常见的原因[3]，因此区分NAFL与NASH、判断是否存在肝纤维化及肝纤维化程度尤为重要。目前肝脏穿刺活检（liver biopsy，LB）是评估NAFLD肝脏病理损伤程度的“金标准”，但因其存在感染、出血等并发症，且有创性、取样及病理诊断误差等缺陷，未能广泛运用于病情的动态监测。因此近年来多项无创诊断方法的出现致力于替代LB。

1 NASH的临床诊断和评估

根据2017年AASLD发布的《非酒精性脂肪性肝病诊断与管理实践指南》，NASH指肝组织病理学肝细胞脂肪变＞5%、伴有炎症和肝细胞气球样变，伴或不伴肝纤维化[1]。目前NAFLD炎症损伤半定量评估系统包括NASH CRN的NAS评分系统及及欧洲的SAF评分。NAS评分系统主要包括肝脂肪变性（0～3分）、小叶炎症（0～3分）和肝细胞气球样变（0～2分），总分≥5分诊断为 NASH，＜3分排除 NASH，4分疑似NASH[4]。但NAS评分系统忽略了肝纤维化程度的评价，不能很好的对脂肪肝的预后进行判断，故而提出SAF评分系统[5]，包括脂肪变性半定量评估、活动度和纤维化，通过SAF评分可同时对肝脏损伤以及肝纤维化进行综合评估，考虑到了纤维化对脂肪肝患者预后的影响，能够更好的评估脂肪肝患者的预后情况。

2 NASH的无创诊断方法

2.1 血清学检测 目前有多种生物化学标志物来预测NASH的发生及纤维化的程度，主要包括血清酶学、炎性细胞因子、细胞凋亡与修复、脂肪组织代谢，此外关于糖蛋白组学、基因、microRNA等近来也有研究，但目前尚无血清学标志物能敏感而特异地诊断NASH[6]。

血清酶学ALT、AST的升高一般与炎症及脂肪变性相关，但转氨酶的水平与纤维化化程度并无相关性，近来有研究显示ALT高于正常值发生NASH的风险较高，其结合年龄、BMI、2型糖尿病、高血压等临床特征可预测NASH，但单独预测NASH准确性不高，因此ALT水平不能诊断NASH。

炎性标志物主要包括炎性细胞因子、铁蛋白及可溶性晚期糖基化终末产物受体。炎性细胞因子主要包括TNF-α、IL-6、超敏 C 反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、穿透素 3 （pentraxin3，PTX3） 等。NASH 患者TNF-α和IL-6水平高于NAFL患者，但两者之间的差异尚不能作为区分NASH及NAFL的标志物，且促炎因子IL-6等在其他炎症时也会升高，故特异性不高[7]。hs-CRP水平随BMI增加而增高，且与肝脏脂肪变性程度相关，但NAFL及NASH的患者hs-CRP水平未见明显差异，故Hs-CRP可以作为诊断NAFLD的参考值，但不能区分NAFL与NASH。PTX3是由众多炎症细胞及组织固有细胞产生的急性期蛋白，可以结合多种可溶性受体配体，参与免疫防御、炎症、细胞凋亡，相较CRP更能迅速反应组织局部的炎症及损伤，有研究[8]表明NAFLD患者血清PTX3较对照组明显升高，NASH患者较非NASH患者血清PTX3高，以2.45 ng/mL为cut-off值区分NAFL及NASH的敏感度及特异度分别为91.1%、71.4%，但尚需扩大样本量进一步验证该结果。近年来越来越多的研究证实高水平的血清铁蛋白与肝脏组织学损伤密切相关，是NASH的独立危险因素。Kowdley et al[9]进行的临床研究证实当血清铁超过正常上限的1.5倍时即可诊断为NASH，且高度提示进展期肝纤维化。但Angulo et al[10]的研究则表明尽管血清铁蛋白与严重肝纤维化相关，但其对肝纤维化的诊断及严重程度的分级准确性并不高。此外也有研究结果显示即使血清铁蛋白处于正常水平，NAFLD患者也可能已存在肝纤维化或肝硬化。尽管血清铁蛋白在诊断NASH及纤维化程度的评估方面尚有争议，但已有研究表明长期高水平血清铁蛋白可增加死亡率[11]。综上，各炎性细胞因子尚不能成为诊断NASH的准确而敏感的指标。

脂肪组织代谢相关因子主要包括脂联素、瘦素、抵抗素、趋化素、内脂素、视黄醇结合蛋白4等。脂联素水平越低，代表肝脏损伤越严重，但关于内脂素、瘦素、抵抗素与视黄醇结合蛋白-4等因子的研究结果各不相同，甚至冲突，也表明脂肪因子并不能成为诊断NAFLD或区分NAFL及NASH敏感而特异的指标。

与细胞凋亡和修复相关的因子主要包括CK-18、Fas配体、TGF-β1等。CK-18与细胞凋亡、坏死、自噬相关，其水平的高低可以评估脂肪变性程度及提示NASH的发生。Tsutsui等人[12]的研究已证实CK-18与肝脏脂肪变性程度、肝小叶炎症、气球样变性及纤维化密切相关，且较血清酶学更有意义。Aida等人[13]进一步深入研究，当血清中CK-18片段水平达230U/L时可诊断为NAFLD，其敏感度为0.89，特异度为0.65，阳性预测值（positive predict value，PPV）为 0.34，阴性预测值（negative predict value，NPV）为 0.64；当 CK-18 片段水平达270 U/L时可诊断为NASH，其敏感度、特异度、PPV、NPV分别为0.64，0.74，0.72，0.67。但因其诊断NASH的敏感度及特异度仍欠佳，且目前尚欠缺大样本量的临床试验，故而限制了其在临床的应用。Fas配体是肝内跨膜蛋白，Fas/Fas配体是调节细胞凋亡的主导调控系统之一，可诱导下游外源性和内源性细胞凋亡信号通路同时激活，使肝细胞凋亡，导致肝脏炎症及纤维化的发生和进展。有研究显示NASH患者Fas及Fas配体水平明显高于NAFL患者，且Fas配体较Fas预测NASH的准确性更高，但其单独作为NASH的预测因子价值不高，故而需联合其他血清学标志物提高准确性[14]。

随着蛋白组学技术的发展，近来研究发现糖蛋白组相关指标可能成为诊断NASH的无创指标。研究发现Fuc-Hpt、Mac-2bp对诊断NASH及相关肝纤维化均有一定价值，两者诊断NASH的AUROC分别为0.73和0.81[15]，此外两者联合诊断NASH的AUROC为0.85[16]。关于基因的研究发现PNPLA3和TM6SF2基因突变与NAFLD患者发生NASH和重度纤维化相关，但基因分型一般用于特定患者或临床研究，无法作为常规检测[17]。此外，有研究显示s100a9基因的表达诊断NASH的AUROC为0.947，较CK-18的诊断价值更高，但目前其在NASH形成过程中发挥的分子学机制尚不明确，且仅在大鼠模型中研究，人体研究尚未开展，故需进一步探索[18]。焦谷氨酸盐也有望成为区分NASH及NAFL的标志物，有研究发现当其cut-off值为4.82mmol/L时，诊断NASH的敏感度及特异度为72% 和85%，但尚需更大样本量的临床试验进行验证[19]。对于合并有代谢危险因素的人群，内环境稳态模型评估胰岛素抵抗（HOMA-IR）有助于对IR相关NAFLD诊断，当HOMA-IR＞4.5时，可诊断为NAFLD[20]，但目前尚无研究证实其可区分NAFL及NASH。

2.2 临床血清学模型 基于目前尚无单独血清学指标可以高效而准确的诊断NASH，故为提高实验室指标诊断 NASH的价值，许多研究者将多项临床指标联合用于肝脂肪变性的预测评分，主要包括脂肪肝指数（FLI）、NASH指数（ION）、NASHTest、NAFLD liver fat score 等[21]，其中 FLI 对 NAFLD的初步筛查有重要价值，当FLI＜30，即可排除脂肪肝，当FLI＞60即可诊断脂肪肝，其灵敏度为87%，特异度为86%，但无法区分NASH及NAFL[22]。当ION≥22，诊断NAFLD的特异度为82%，ION≥50诊断NASH的特异度和敏感度分别为92%、60%[23]。上述各评分模型虽提高了诊断的准确性及敏感性，但均不能代替LB。

2.3 影像学检查 影像学检查包括超声、CT、磁共振成像（MRI）、磁共振弹性成像（magnetic resonance elastography，MRE）、磁共振波谱分析（magnetic resonance spectrum，MRS）、瞬时弹性成像（transient Elastography，TE），目前上述检查方法均无法鉴别NASH及NAFL。

超声检查是一项非侵入性的影像学技术，具有安全、经济的特点，故可广泛用于脂肪肝的筛查与诊断。相关研究表明超声诊断脂肪肝的敏感性为60%～94%，特异性为66%～95%。尤其对于轻度脂肪肝敏感性较差，当肝脏脂肪变性程度小于20%时，超声诊断非酒精性脂肪肝病的敏感性仅55%，且容易受体型、肠内气体等的影响。此外，超声检查虽然可重复操作，但其结果一致性欠佳，有研究显示不同操作者及同一操作者多次测量超声结果符合率仅为72%和76%[24]，故常用于脂肪肝的普查，难以用于定量诊断及疗效评估。

CT诊断NAFLD的价值与超声相似，当CT显示肝脏密度比脾脏小于10HU以上或者肝脏密度小于40HU即可诊断为脂肪肝，平扫CT对于肝脏脂肪变性区域超过30%的诊断特异度和敏感度分别为100%和82%，然而对于脂肪变性区域＜30%的患者，其诊断准确性明显降低[25]。故临床上对于轻度到中度NAFLD不推荐使用CT检查。且CT检查存在辐射暴露的问题，故限制了其在儿童及长期临床随访中的应用。

质子磁共振频谱分析（hydrogen proton magnetic resonance spectrum，1 H-MRS）是近年发展起来的新型影像学检查方法，可以分辨出极低含量的脂肪，且敏感性极高，对于B超及CT无法诊断的轻度脂肪肝其敏感性为80%-91%，特异性为80.2%-87%，1%的变化就能分辨出[26]，诊断价值优于超声、CT和传统MRI，诊断脂肪变性程度的准确性与组织病理学检查相当，可以作为无创诊断NAFLD肝脂肪含量的“金标准”，多用于评估治疗后肝脏脂肪变性的改变程度，但因其价格昂贵，易受磁场强度等的影响，对于不均匀脂肪肝存在抽样误差，且耗费时间较长，需患者摒气配合，从而限制了MRS在临床的广泛应用。1H-MRS检测技术仅能定量评估部分区域的肝脏脂肪，而质子密度脂肪分数（proton density fat fraction，MRI-PDFF）则可以对整个肝脏脂肪变性进行评估。Tang A al[27]的研究显示MRI-PDFF值的高低与组织学肝脂肪变程度相一致，分别以6.4%、17.4%、22.1%为cut-off值诊断脂肪变性＞5%、＞33%和，＞66%的敏感度为86%、64%、71%，特异度为83%、96%、92%。此外Noureddin M et al[28]的研究还发现MRI-PDFF对检测肝脂肪变比组织学更加敏感。两者均是良好的量化肝脂肪变非侵入性检测方法，诊断价值无明显差异。

TE主要通过低频瞬时剪切波在不同硬度的组织中传播速度不同的原理来评估组织硬度，通过检测剪切波传播速度来准确定量地计算组织硬度。此外利用超声在脂肪组织中传播出现显著衰减的特点，通过受控衰减参数（controlled attenuation parameter，CAP）可以定量检测肝脂肪变。TE不仅可重复性较强，且可检测约1×4cm大小的肝脏组织，远大于LB所取得的肝脏组织量。目前用于临床的TE技术包括法国的FibroScan和我国的FibroTouch。法国 Sasso et al[29]的研究表明以病理学为金标准CAP诊断轻中重度脂肪变性的AUROC分别为0.91、0.95、0.89。虽然基于CAP的Fibroscan评估脂肪变性准确性较高，但其操作失败率可达6.2～7.7%，且随着BMI的增加其失败率越高，当BMI＞40 kg/m2时失败率可达58.4%，NASH患者通常伴有肥胖及代谢综合征，故而限制了应用，其准确性也随皮肤至肝包膜距离的增加而降低，针对该缺陷，应用M+及XL+探头检测可将失败率降至3.2%[30]，故而TE作为一项无创、快速和能客观评价肝纤维化、动态监测肝纤维化进展的无创诊断方法，具有较好的发展前景。

2.4 其他 有研究显示呼吸试验也可作为区分NAFL及NASH的无创诊断方法，主要包括14C氨基比林呼气试验（C-aminopyrine breath test，C-ABT）、14C 咖啡因试验 （C-caffeine breath test，CBT）及测定挥发性有机物（volatile organiccompounds，VOC）。C-ABT 区 分 NAFL 及 NASH 的AUROC为0.76，但其值与脂肪变性严重程度不一致[31]。VOC是氧化应激的标志物，Verdam et al[32]关于呼出气中VOC的研究发现n-tridecane，3-methyl-butanonitrile及1-propanol诊断NASH的AUROC为0.77，Arasaradnam et al[33]关于泌尿系VOC的研究发现其可以区分NASH及NAFL，AUROC为0.79，敏感性及特异性分别为 0.73、0.79。CBT[34]无法区分NASH及NAFL，但其可以预测显著纤维化及肝硬化。

3 结语

综上所述，NASH可发展为肝硬化及肝癌，早期发现并干预NASH尤为重要，目前NASH的诊断仍以病理结果为金标准，目前尚无任何一种无创诊断方法可以准确而敏感地区分NAFL和NASH及判定肝纤维化程度，一些血清学指标及相关诊断模型仅可作为辅助诊断NASH的手段，新的影像学技术也在不断探索中。虽然目前尚无非侵入诊断方法能完全代替肝穿刺活组织检查，但联合不同种方法可以提高诊断的准确度，相信随着对NAFLD及NASH发病机制的深入研究，终将会建立一种无创诊断方法能够兼顾有效、准确、经济。