组蛋白乙酰化与DNA甲基化的交互调控在肝脏炎症反应中的作用

王 瑶，龚作炯

王瑶，龚作炯，武汉大学人民医院感染科 湖北省武汉市 430060

核心提要： 肝脏炎症反应是肝脏疾病过程中常见的病理反应, 也是肝脏疾病转归的关键因素. 近年来, 许多研究证实, 组蛋白乙酰化与DNA甲基化调控在肝脏炎症的发病机制中发挥了重要作用.

0 引言

肝脏炎症反应包括无菌性炎症和感染性炎症, 而持续性的炎症反应可促进肝脏疾病的进展[1]. 研究表明, 以通过蛋白质复合物的翻译后修饰而不改变基础遗传DNA序列而发生的遗传基因表达变化为特点的表观遗传学对肝脏炎症反应有着复杂的调控机制[2], 这些翻译后修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、SUMO化(sumoylation)、泛素化、羰基化和糖基化, 以及DNA甲基化修饰[3,4]. 而组蛋白乙酰化与DNA甲基化的交互调控通过调控基因的转录和沉默来影响疾病的发生发展[5].本文就组蛋白乙酰化和DNA甲基化的交互调控对肝脏炎症反应的影响作一述评, 以期深入阐明表观遗传调控肝脏炎症反应的分子机制.

1 组蛋白乙酰化调控肝脏炎症反应

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs), 顾名思义是修饰结合染色体上的经典组蛋白分子的酶, 包括组蛋白H3、组蛋白H4, 这些组蛋白上存在丰富的赖氨酸(lysine, 缩写为“K”)位点, 如H3上的第9个赖氨酸位点H3K9容易被乙酰化(acetylization, 缩写为“ac”)修饰,则简称为“H3K9ac”. 但随着深入的研究发现, HDACs也可修饰非组蛋白, 这些组蛋白/非组蛋白上存在着数量不一的赖氨酸位点, 这些位点被乙酰化修饰的程度也各不相同. 例如, 作为晚期炎症介质的非组蛋白的高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)同样也可以受乙酰化调控, 当核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)中的lysine被高度乙酰化时, 其与染色质结合疏松, 可由细胞核转移入细胞质, 并使其在细胞质内聚集从而不能进入细胞核, 此时分泌至胞外的HMGB1增多, 诱导的炎症反应也随之增强[6].

本课题组长期从事组蛋白乙酰化调控与肝脏炎症反应的相关研究, 肝衰竭的发生发展的实质是肝脏内巨噬细胞参与的“二次打击”[7], 我们发现不管是广谱的HDACs抑制剂Entinostat(MS-275)、Trichostatin A(TSA),Ⅰ类HDAC分子HDAC2的特异性抑制剂Santacruzamate A(CAY10683), 还是Ⅱ类HDAC分子HDAC6的特异性抑制剂Ricolinostat(ACY-1215)均可抑制肝衰竭过程中内毒素(lipopolysaccharide, LPS)诱导的M1型巨噬细胞活化[8-11]. 深入的机制研究发现, 这些HDACs酶或是调控组蛋白H3/H4, 或是调控非组蛋白核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)来影响炎症相关途径[9]. 组蛋白乙酰化调控肝脏炎症反应的过程中也存在诸多值得深入研究的问题, 如组蛋白H3/H4本身也可作为炎性因子诱导肝脏炎症反应[12], 但这些组蛋白是否源于细胞核, 其出核胞外释放的机制是否与HMGB1类似除了被乙酰化修饰, 其他类型的表观遗传修饰是否也可诱导这些组蛋白胞质移位越来越多参与炎症反应的分子, 如三羧酸循环中与M1型巨噬细胞活化能量代谢有关的关键调控分子异柠檬酸脱氢酶-1(isocitrate dehydrogenase-1,IDH1)也可直接受乙酰化调控, 但这些分子上的哪些赖氨酸位点容易受乙酰化调控都值得深入研究.

同时对于肝脏感染性炎症, 我们发现乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)患者肝脏炎症反应越严重, 其血液、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及肝脏组织内的HDACs活性越高[8,13,14], 且经恩替卡韦(entecavir, ETV)抗病毒治疗24 wk后, 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者肝脏的炎症程度明显降低并伴有HDAC2、HDAC6及组蛋白H3的水平下降, 这说明在在抗病毒治疗过程中乙肝病毒的脱氧核糖核酸(HBV DNA)的变化与组蛋白H3乙酰化程度有关[14]. 至于组蛋白H3的乙酰化修饰主要发生在HBV复制过程中哪一个关键分子(如乙HBV X基因(HBx)、前基因组RNA(pregenomicRNA, pgRNA)、环状DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA) )上； H3上几号赖氨酸位点容易发生乙酰化修饰； 除了乙酰化修饰H3上的赖氨酸位点, 其他修饰方式如甲基化修饰是否也改变H3的构象； 除H3之外的其他组蛋白是否同样也被修饰, 都有待进一步研究. 但可以肯定的是, 自Pollicino等[15]首次发现组蛋白H3与H4均可直接与cccDNA发生结合, 改变H3/H4的乙酰化程度就可间接地调控HBV cccDNA微小染色体的转录水平以来. 科学家得出启示, 只要改变结合在cccDNA上H3/H4的水平就可影响cccDNA的转录水平, 不管是乙酰化还是其他方式的表观遗传调控. 故Rivière等[16]发现组蛋白甲基转移酶SETDB1对组蛋白H3上第9号赖氨酸进行3甲基化修饰(简称“H3K9me3”)来改变cccDNA染色质结构, 进而调控HBV cccDNA转录水平.

2 DNA甲基化调控肝脏炎症反应

DNA甲基化是指基因组CpG岛二核苷酸第5位碳原子在DNA甲基转移酶(DNA methylation, DNMT)的催化下结合一个甲基基团, 其产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC). CpG岛是人类基因组二核苷酸富含序列, 通常位于基因启动子区域. 甲基化程度越高, 其转录活性越低； 而去甲基化可使基因的转录活性增强. 越来越多的证据表明, DNA甲基化调控巨噬细胞在慢性炎症、炎症性疾病中发挥着重要作用[17]. 而肝脏炎症反应对于肝衰竭、肝纤维化、非酒精性脂肪肝等疾病的发生发展都明显的促进作用.

DNMT1抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine(5-azadC)干预LPS诱导的RAW264. 7巨噬细胞中发现, 细胞因子信号传导抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)启动子甲基化水平减少, SOCS1表达升高, 抑制Janus激酶2(janus kinase 2, JAK2)/信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)信号通路, 减少了炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)的释放, 抑制组织炎症损伤[18]. 因此,在肝脏炎症反应过程中运用DNMT1抑制剂是否可以减轻炎性损伤则有待进一步研究.

分离四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱导的肝纤维化小鼠的肝脏巨噬细胞, 通过DNA甲基化测序发现了与CpG岛相关的26个基因启动子区域的甲基化状态, 其中鉴定出的脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸磷酸酶相互作用蛋白2(proline serine threonine phosphatase interacting protein 1, PSTPIP2)基因高甲基化状态由DNMT3a和DNMT3b介导, PSTPIP2的去甲基化状态可增强PSTPIP2的表达, 诱导替代性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)极化抑制肝纤维化中经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)极化, 来减轻小鼠肝脏炎症反应, 进而缓解肝纤维化[19]. 故DNMT同样可以通过调控巨噬细胞的极化影响肝纤维化的转归.

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是H2S的前体, 其通过胱硫醚β-合酶(cystathionine β-synthase)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)催化的转硫途径形成,并且可用作炎症的新型调节剂. Hcy可抑制巨噬细胞中CSE的表达和H2S的产生, 引起CSE启动子区DNMT和DNA甲基化水平的增加[20]. 深入研究发现, CSE启动子区富含CpG岛, 可被DNA甲基化修饰, 有助于巨噬细胞中CSE转录和H2S产生的减少, 从而促进动脉粥样硬化的发展[21]； 同样地, 在肝脏脂质代谢障碍引起的炎症反应过程中, 甲基化修饰CSE是否也可作为肝脏脂质代谢类疾病潜在的治疗靶点则有待进一步研究.

3 DNA甲基化与乙酰化交互调控肝脏炎症反应

早在1998年Nature发文报道了DNA甲基化与乙酰化交互作用的物质基础, 即基因启动子区域的CpG岛被甲基化修饰时, 甲基化DNA特异性的转录抑制分子甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2, MeCP2)则可与甲基化的CpG结合, 随后与SIN3转录调控蛋白家族成员A(SIN3 transcription regulator family member A, Sin3A)结合, 并进一步与异二聚体Mad/Max形成复合物, 募集HDACs[22]. 但进一步研究发现, DNA甲基化与组蛋白乙酰化直接存在更直接的关联： DNMT1 686-812氨基酸残基可与HDAC1直接结合, HDAC1催化区域内的150-242氨基酸残基可与DNMT1结合[23].

除了此之外参与DNA羟甲基化过程的DNA去甲基化酶(ten-eleven translocation, TET)同样也可以与HDAC直接相互作用, 而DNA羟甲基化是指5-mc在DNA TET2的作用加一个羟基形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC). 研究发现, TET2特异性识别CpG的半胱氨酸(cysteine, Cys)与双链B螺旋(double stranded b helix, DSBH)两个锌指结构可与HDAC2结合[24]. 并在LPS诱导的机体免疫应答期间, TET2的缺失会导致晚期炎症介质IL-6的升高, 深入研究发现, TET2能特异性靶向调控IL-6启动子核因子κB抑制因子ζ(nuclear factor-kappa B inhibitor kinase ζ, IκBζ), 而此过程并不赖DNA甲基化和羟甲基化作用, 而是通过募集组蛋白去HDAC2抑制IL-6的转录[24]. HDAC抑制剂(HDAC inhibitor, HDACi)可以使哺乳动物基因组去甲基化, 研究表明, DNMT1的表达虽然不受HDACi depsipeptide影响, 但depsipeptide对p16、SALL3和GATA4基因甲基化的影响包括以下两方面：(1)depsipeptide可以直接减少DNMT1与多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1, 也称p16)、转录因子Sal-likeprotein3(SALL3)和GATA结合蛋白4(GATA4)等基因启动子的结合, 引起这些分子的去甲基化； (2)通过抑制组蛋白DNMT G9a和SUV39H1的表达, 导致这些基因启动子周围H3K9的二甲基化和三甲基化程度的降低, 进而引起这些分子表达的增加[25].

DNA甲基化与组蛋白乙酰化可联合调控疾病的发生发展. 研究发现, DNMT抑制剂(DNMT inhibitor,DNMTi)5-Aza 2-deoxycytidine与HDACi TSA联合运用可通过抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)-细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路和激活STAT3-组蛋白TET JMJD3(JmjC domain containing protein 3)通路, 减轻内毒素血症引起的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)[26]. 由于HDACi和DNMTi被证明能够影响免疫系统, 表观遗传药物和免疫抑制剂的组合被认为是一种有前景的癌症治疗[27,28]. 其他临床前研究与临床试验表明HDACis是化学增敏剂, 增加了化疗药的治疗下癌细胞的敏感性[29-31].HDACi和DNMTi治疗在与化疗药物联合使用时已显示出疗效[32]. 目前, HDACi与DNMTi的联合运用治疗急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)已进入临床实验阶段[33,34], 但联合运用的机制仍在争论中, 但可以肯定的, 联合治疗对转录本的影响明显大于任一处理单独调节的基因的总和, HDACi与DNMTi的联合运用具有协同效应[35].

对于肝脏相关炎症的干预, 通过调控乙酰化来影响DNA甲基化或是通过DNA甲基化影响乙酰化的报道较少, HDACi与DNMTi的联合运用也尚处于空白阶段. 因此, 在肝脏炎症反应过程中, 单独通过改变组蛋白乙酰化或是DNA甲基化则势必影响对方的生物学效应改变,研究表观遗传调控的交互作用势在必行. 表观遗传调控的交互作用在免疫抑制剂治疗肝脏自身免疫性肝炎的过程中是否同样可以加用HDACi或是DNMTi, 或是HDACi与DNMTi的联合运用? 肝脏内的“二次打击”引起的免疫炎症级联反应是否同样也适用? 病毒性肝炎活动期肝细胞受损过程中HDACi与DNMTi的联合调控是否可减轻肝脏受损程度? 都值得深入研究.

4 结论

肝脏炎症反应是肝脏疾病慢性化的关键诱导因素, 调控炎症相关分子的表达对炎症的发生尤为重要. 肝脏炎症反应过程中的表观遗传调控特别是组蛋白乙酰化的正调控与DNA甲基化负调控, 可从蛋白质的翻译水平即DNA的转录水平影响基因的表达. 组蛋白乙酰化与DNA甲基化之间无明确的级联调控关系, 一般可通过交互作用或协同作用影响基因的表达. 同时, HDACi与DNMTi的联合运用具有协同效应, 两者联用抑或是配合其他化疗药物的实用, 在治疗恶性肿瘤的临床实验阶段中已初具成效. 但在肝脏炎症甚至是肝脏疾病中的研究, HDACi与DNMTi的联合运用尚处于空白阶段. 因此对于肝脏炎症反应过程, 分别明确组蛋白乙酰化与DNA甲基化的基础调控作用, 深化探讨两者交互作用的分子机制, 明确HDACi与DNMTi联合用药的科学内涵, 则有着广阔的运用前景.