化妆品功效评价（XI）——体外试验技术在发用化妆品功效评价中的应用

何文丹 ，刘 磊 ，杨舒颜 ，唐 颖

（1.北京工商大学 理学院 化妆品系，北京 100048；2.北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048）

发用化妆品包括育发、染发、烫发类的特殊用途化妆品和清洁、护发类的非特殊用途化妆品。它们的作用对象包括毛发及其赖以生长的皮肤区域（头皮）。发用化妆品的品种繁多，功能和作用机理各异。例如洗发水用于清洁头发和头皮，护发素用于保护头发纤维并提供理想的外观和触感，这些产品主要改变头发表面的粗糙度、摩擦和粘附性能，而染发和烫发产品则主要通过改变头发内部的化学成分及相关物理性质来实现其功能。近年来，我国发用化妆品行业发展迅速，市场竞争激烈，而消费者日趋理性，对产品功效越来越重视。如果化妆品功效宣称缺乏充分的科学依据，势必影响产品的市场推广。因此，如何运用生物学、化学和物理学手段对发用化妆品的不同功效进行科学表征和评价，是发用化妆品研发的重要课题，也是化妆品行业十分感兴趣的问题。

目前对化妆品的功效评价主要通过体内试验和体外试验两种技术途径实现。体内试验以动物试验和志愿者人体试验为主，还包括了人体感官和主观性评价。体外试验主要通过离体培养的细胞、微生物和组织等体外生物学模型进行。此外，由于头发的发干部分是由无生命的蛋白质纤维构成，发用化妆品的体外评价还可以采用以波谱学、理化分析为代表的材料学仪器分析。2013年欧盟全面禁止化妆品动物试验禁令的提出，推动了体外试验技术在化妆品评价领域的发展与进步。与此同时，相对于试验周期长、成本高、主观性强的传统动物试验和人体试验，体外试验在评价时还具有试验周期短、经济简便和易于开展深层次机理研究等优点，因此越来越受到行业和消费者的重视。

根据作用部位的不同，可以将发用化妆品分为作用于头发纤维和作用于头皮两类。对于作用部位在头发纤维的大多数发用化妆品（包括清洁、修复、漂染、定型等），其功效评价主要针对头发纤维的形貌、结构、化学成分和机械性能等的改变；而对于作用部位在头皮的发用化妆品（如去屑、育发），其功效评价主要通过体外生物学模型进行。

1 针对头发纤维的体外评价

人的头发纤维直径为50～100 μm，由角质层、毛皮质和毛髓质三部分组成。最外层的角质层覆盖着毛鳞片，构成了毛发表面约5 μm厚的保护层。最内侧区域的毛髓质厚度为5～10 μm，由中空细胞组成。位于毛发中间区域的毛皮层（约45～90 μm）是毛发主要的结构支撑部分，由长圆柱形组装的皮质细胞和细胞膜复合物（CMC）组成。皮质细胞由卷曲螺旋的α-角蛋白和角蛋白缔合蛋白（KAP）横向组装成的微纤维和间质材料构成[1]。头发纤维由无生命的死细胞构成，因此，针对头发纤维的体外评价主要运用多种材料学和生物物理学仪器分析手段开展，包括显微成像分析、光谱、蛋白质组质谱、机械张力和摩擦力学等分析方法。

1.1 显微成像分析

运用各种显微成像技术可方便地对头发纤维的微观结构进行观察，并对包括化妆品、光照、机械损伤、干燥等对毛发的影响进行评估。

1.1.1 扫描电子显微镜

扫描电子显微镜（Scanning electron microscopy，SEM）是一种在真空下利用聚焦电子束扫描能够使样品表面产生放大和清晰图像的成像技术[2]。利用SEM可以对头发纤维的微观结构和形态学变化进行直接观察，是对头发进行显微成像分析最常用的方法。例如头发纤维表面毛鳞片的形态容易受到光照、风化和梳理的影响，而发梢与发尾通常存在明显的老化差异。2010年巴黎欧莱雅集团（中国区）用SEM对一名女性的4.3 m长发的发根、中间部分和发尾部分进行观察，发现毛发根部的毛鳞片组织结构完好，中间部分的毛鳞片翘起、边缘变得粗糙，而发梢的毛鳞片已经完全脱落，直接暴露了毛皮质[3]。SEM还能观察发用化妆品处理对头发微观结构的影响，从而对其损伤或修复功能进行定性或半定量评价。韩国延世大学的Ahn等[4]曾报道了一项永久性染发剂对毛发损伤的SEM研究，发现未染色的毛发具有完整而致密的毛鳞片，毛发表面均匀有光泽，而染发的毛鳞片则变得破碎、剥离和脱落。2012年，西班牙学者Fernández等[5]通过SEM观察发现使用朝鲜蓟提取物制备成的护发剂对头发表面毛鳞片在老化过程中的翘起有改善作用，因此认为该提取物具有护发功效。

1.1.2 透射电子显微镜

透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）是将经加速和聚焦的电子束投射到非常薄的样品（一般需要切片）上，利用电子与样品中的原子碰撞产生立体角散射而成像的一种显微成像技术。该系统是由封装在低压抽空柱子中控制光束的电磁透镜组成的发射电子源，当电子束通过样品时，由于衍射电子束的角度分布而形成可观察的图像。利用TEM可以观察头发纤维内部横截面的超微结构。在上述Ahn等[4]的研究中，还同时应用TEM观察永久性染发剂染发引起毛发表层在横截面上的变化，发现染发导致的结构损伤（表现为角质层细胞的破碎和空洞化）在6～24 h内最严重，需要8周才能恢复到未染发状态，因此建议消费者补染发的间隔为8周时间[4]。类似的，2016年巴西的一项利用TEM分析毛发内部结构的研究也观察到了头发在紫外线辐射和水洗过程中的微观结构损害，认为光照和过度清洗都会使毛发变得脆弱[6]。而韩国的一项TEM研究表明，在护发产品中添加原花青素低聚物可以减缓漂染处理中毛发皮质中黑素小体和蛋白质的降解[7]。

1.1.3 原子力显微镜

原子力显微镜（Atomic force microscopy，AFM）是通过探针与被测样品之间的微弱的相互作用力即原子力来获得物质表面形貌的信息，从而获得纳米尺度显微成像的技术。AFM由于具有超高图像分辨率、测试和样品制备时的简易性（无需SEM和TEM时的喷金制样和高真空条件），在局部的三维拓扑成像时具有独特的优点。在过去的20年里，AFM被广泛地应用于研究头发角质层的各种微纳结构（如A层、外表皮、内皮细胞和细胞膜复合物），并用这些数据来比较研究环境因素和化妆品处理对头发粗糙度和摩擦力学性质的影响，从而对产品的护发效果进行评价。如Chen等[8]利用AFM的不同模式对头发表面上的护发素的分布、厚度与头发摩擦力学性质之间的关联性进行研究。AFM还可以用来表征毛发纤维的各种物理特性，如摩擦力、附着力、磨损、弹性刚度和黏弹性等纳米力学性能。2013年，英国朴茨茅斯大学使用AFM图像确定了头发表面亚结构的微尺度摩擦系数、尖端-表面粘附力和相应的粘附能量值[9]。另一项研究[10]通过AFM成像表征了头发纤维的纳米杨氏模量，并发现漂白后毛发表面的模量降低，表现为纤维弹性下降。

1.1.4 光学相干断层扫描

对头发纤维截面的高分辨率图像分析还可以通过光学相干断层扫描（Optical coherence tomography，OCT）进行。OCT利用低长度相干干涉测量的原理，通过设备的直接相干反射光子获得具有高分辨率层析成像的生物结构图像[11]。2014年，巴黎欧莱雅集团（美国区）使用X射线断层显微镜研究了非裔美国女性毛发断裂情况，发现当头发纤维拉伸超过30%后，毛发的横截面积（尤其是断裂发生的部位）明显减小[12]。此外，由于OCT可以分析毛发在相同部位由外界因素引起的结构和形态学变化，具有对同一部位的变化进行精确比较、减小测量误差的优点。2016年，巴西圣保罗大学报道了使用OCT观察氧化型染发剂染发引起同一部位毛发的超微结构变化，研究发现染发后毛发的散射系数和折射率增加，而毛髓质和毛皮质的OCT图像清晰度降低，从而判断髓质和皮质结构受损[13]。

1.2 光谱分析

光谱分析是根据物质的光学特性，鉴别物质及确定其化学成分的技术。目前在发用化妆品功效评价中最常用的是紫外可见光谱、荧光光谱、红外光谱和拉曼光谱。

1.2.1 紫外可见光谱

紫外可见光谱（UV-Visible spectroscopy）包括紫外可见光区域（320～780 nm）的漫反射光谱（Diffuse reflectance spectroscopy，DRS）和吸收光谱（Absorption spectroscopy，AS）。漫反射光谱反映了物质在紫外可见光波段的反射率，常用于判断样品的色彩和明暗度。通过将放射率数值转换为CIELab色彩空间，漫反射光谱可用于定量评价染护发产品处理后头发纤维的光泽和颜色变化。2016年，北京工商大学唐颖[14]通过漫反射光谱研究了包括自然白/黑发、灰发和漂染发等不同类型的中国人头发在UVA光老化中的颜色变化，结果发现，不同类型的头发对紫外辐射的敏感程度和光变色反应具有明显差异，漂染过的头发表现出光变暗，而自然白发表现出光黄化。而Dario等[15]的一项研究发现，将石榴提取物复配成护发素可以有效减少染发在光老化中的颜色变化。吸收光谱反映了物质生色团在可见光波长范围内的吸收特征，常用于染料或吸光物质的定量分析。2014年，Pires-Oliveira等[16]通过分析毛发提取物溶液的吸收光谱，比较研究了4种表面活性剂引起的毛发损伤，发现吸收峰面积与毛发降解得到的黑色素颗粒和蛋白质成分成正比，建立了对毛发损伤进行表征的分光光度法。

1.2.2 荧光光谱

荧光光谱（Fluorescence spectroscopy）是指利用某些荧光物质在紫外光照射下产生荧光的特性进行物质的定性或定量分析的方法。头发角蛋白中的氨基酸如色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸都是荧光基团，因此可以通过荧光光谱评估头发中蛋白质成分的降解以及护发产品中功效成分对毛发的保护作用。2012年，Estibalitz等[17]发现通过对头发中色氨酸荧光强度的监测可定量毛发的光损伤；并在此基础上发现使用大米提取物制备成护发素对头发具有光防护作用[5]。除了二维发射光谱对色氨酸进行定量检测外，还可以利用三维荧光光谱得到指纹图谱对头发纤维中存在的多种氨基酸及其氧化产物同时进行分析，来鉴别不同化妆品处理过的头发类型及其光老化规律[14]。

1.2.3 傅里叶变换红外光谱

傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT IR）由化合物的分子振动能级在吸收红外光照后发生跃迁而产生，包含了化合物的官能团、结晶态等结构信息。将FT IR与ATR衰减全反射相连，可直接对头发纤维进行测量，利用红外光谱的指纹特征性评估不同化妆品处理（如保湿、漂白和染色等）对头发角蛋白分子结构和形态的影响[18]。2016年，北京工商大学唐颖等[14]通过FT IR指纹图谱对不同漂染处理后的头发样本进行分析，发现UVA和过氧化氢可以使毛发中胱氨酸的二硫键断裂，产生半胱氨酸，而后者易被氧化产生大量磺基丙氨酸。由于头发表面胱氨酸含量相对恒定（约11%～18%），因此磺基丙氨酸可用来监测高硫蛋白的氧化程度。

1.2.4 拉曼光谱

拉曼光谱（Raman spectroscopy，RS）是利用化合物受光照射后发生振动产生的非弹性散射光谱（“拉曼效应”），对物质的组成和分子结构进行定性和定量分析的技术。对头发纤维拉曼光谱的测量，可以反映蛋白质主链的骨架振动、氨基酸的侧链构象与存在形式以及外部环境变化引起的微小改变（S-S的构象和蛋白质分子的二级结构等）[19]。2006年—2010年，日本中央研究实验室通过一系列基于拉曼光谱的机制研究，探讨了老化和漂染等对毛发在黑色素含量、蛋白质纤维结构和抗拉强度等方面的影响[20，21]。他们通过直接分析不同年龄、不同处理（漂白发或黑色头发）在不同深度横截面的拉曼光谱，发现随着年龄的增长，毛发皮质区黑色素颗粒含量减少[22]；而漂白处理后毛发中的二硫键从角质层到皮质层的含量降低，同时半胱氨酸含量增加，此外，漂粉中的氧化剂还促进了头发皮质中黑色素颗粒的分解，使黑发在漂白过程中二硫化物基团的裂解水平更高[23]。

1.3 色谱

色谱（Chromatography）分析是按物质在固定相与流动相间分配系数的差别而进行分离、分析的技术。在评价化妆品对毛发的损伤程度时，常利用色氨酸对蛋白质成分的损失进行定量评估，而用荧光分光光度法定量色氨酸容易受到检测系统中其他荧光物质的影响。2017年，Dario等[24]开发了一种使用具有荧光和UV检测的高效液相色谱法（HPLC），在毛发样品碱水解后对色氨酸和光氧化物犬尿氨酸进行定量检测的方法。结果表明，漂白和染色过程会导致蛋白质/氨基酸的损失，但色氨酸不会在毛发的光老化中大量降解。Khumalo等[25]将头发经过盐酸水解后结合氨基酸分析仪进行色谱分析，发现受损的毛发中的精氨酸、瓜氨酸和胱氨酸含量降低，谷氨酰胺水平增加。此外，色谱还常与质谱联用，广泛用于化妆品中的功效成分或禁限用成分的定量检测。

1.4 质谱

质谱（Mass spectrometry，MS）是将被测物质离子化，按离子的质荷比分离，通过测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。毛发中的角蛋白和角蛋白缔合蛋白（KAP）赋予了毛发重要的结构和机械性能。基于蛋白质组学的质谱技术可以通过鉴定毛发中存在的所有角蛋白和主要KAP中氨基酸基团的修饰变化，从而对不同化妆品处理或环境因素对毛发纤维蛋白质的影响进行表征。2013年，新西兰农业研究所Dyer等[26]使用LC-MS/MS鉴定碱处理、漂白处理前后毛发样品中蛋白质含量变化，结果表明碱处理会轻微增加毛发的氧化损伤程度，而漂白处理对毛发角蛋白（主要是半胱氨酸）造成明显的氧化损害。2016年，北京工商大学和Dyer合作采用此技术分析中国人的常染发人群的头发样本，发现染发的蛋白质氧化水平比未染发增加了近1.6倍，因此常染色的毛发更容易受到日光损伤[27]。

1.5 热分析

热分析是在程序控温下，测量物质的物理性质随温度变化的一类技术，包括热重分析（TG）、衍生热重分析（DTG）、差热分析（DTA）和差示扫描量热法（DSC）。其中，DSC常用于角蛋白变性温度以及角蛋白变性焓的测定[28，29]。近年来，DSC越来越多地用于护发产品的功效评价。2011年，Rigoletto等[30]通过DSC评估毛发角蛋白降解和评价化妆品对损伤毛发的修复效果。结果表明，随着热处理温度从205 ℃上升到232 ℃，角蛋白的变性温度和变性晗均显著下降，蛋白质降解更加严重，而使用聚合物（月桂基甲基丙烯酸酯共聚物、聚季铵盐-55等）对毛发进行处理后，可有效降低角蛋白的热降解和减轻毛小皮损伤。2016年，花王研究发现当干发中的α-角蛋白发生变性和降解，湿发的DSC变性温度反而降低，提出DSC还应与XRD、拉伸实验等方法联用以更好地理解化妆品对毛发的实际作用效果[31]。

1.6 机械性能分析

毛皮质中的α-角蛋白和二硫键决定了毛发纤维的机械性能（拉伸性和扭转性）。与此同时，毛发的机械性能还受到各种环境因素的影响：相对湿度或温度的升高会导致杨氏模量的降低和延展性的增加，而扭曲会对毛发纤维造成伤害，导致断裂应力、断裂应变和杨氏模量的降低[32]。对毛发的拉伸等机械性能分析可以利用美国英斯特朗INSTRON系列万能材料测试仪、英国戴亚斯特隆公司（Dia-Stron） MTT拉伸试验机等仪器进行测定，测试参数包括拉伸强度、断裂应力、断裂应变曲线、断裂伸长率等[30-33]。Davis等[33]通过拉伸性测试和扭转测试发现一个包含咖啡因、烟酰胺和泛醇的配方具有增强毛发拉伸力和柔韧性的功效。毛发纤维在外力作用下的拉伸性和扭转性还与其柔韧性相关，除了护发产品，还可用于评价毛发造型类产品。例如，上海工程技术大学Yan等[34]通过测定一种聚氨酯聚合物涂覆后对毛发机械性能的影响，评价这种发用定型剂的形状记忆效应和耐水洗性能。

1.7 梳理性能表征

毛发纤维的摩擦系数和弹性特性是毛发梳理性能中的重要物理参数。与毛发的摩擦学特性紧密相关的是其毛干表面的脂质（18-甲基二十烷酸）和角蛋白构成的毛鳞片。当毛发光老化或损伤后，脂质流失、毛鳞片变得翘起、剥落，就会导致毛发表面变得粗糙，摩擦系数上升，同时手触摸时的柔软度下降，毛发变得难以梳理或易打结。因此，表征毛发表面的摩擦学性质对于量化梳理性能和评估洗护发产品的功效十分重要。Chevalier[35]通过尼龙螺纹实验得到了计算单根毛发的自摩擦系数方程，并用此测得湿发的静摩擦系数明显高于干发，还发现碱处理会导致毛发摩擦系数的不可逆增大。自20世纪50年代Roeder开发首个毛发静摩擦力的测试方法以来，目前已有多种方法和技术可对毛发-毛发界面的摩擦力进行定量测定，包括Dussaud的“斜面法”和Luengo的“AFM悬臂法”等[35，36]，并出现了专门针对毛发的测试仪器，方便对发用化妆品梳理性能进行评价，如Dia-Stron MTT系列测试仪和亚什兰公司的Aqualon SLT组件等。圣保罗大学Da等[37]使用Dia-Stron MTT175测试仪分析不同护发剂对染发后毛发的保护作用，结果表明含烷三醇和泛醇的配方可有效降低毛发的梳理阻力。

2 针对头皮的体外评价

毛发的生长离不开头皮上的毛囊组织。毛囊是头皮的表皮向真皮处下陷而形成的重要的附属结构，分为表皮层与真皮层两部分。毛囊表皮层包括内根鞘（IRS）和外根鞘（ORS），内根鞘在皮脂腺开口处与内陷的表皮水平相连，起决定毛发形状的作用。外根鞘形成突起的毛囊隆突区，含有多种干细胞，这些干细胞与附近的上皮细胞、内外根鞘、基底膜或者纤维细胞相互作用调控毛发的生长。对于作用部位在头皮的育发、去屑类化妆品，主要通过人工培养的细胞、微生物模型和离体的毛囊组织来进行相关功效的体外评价。

2.1 细胞模型

育发类化妆品产品在功效评价时常采用真皮乳头细胞、角质细胞和毛囊上皮细胞，通过受试物对细胞增殖的促进作用、细胞因子（如VEGF）和相关基因表达的变化等来衡量其功效成分对毛发增长的促进效果。韩国学者Rho等[38]报道了木香烃内酯（一种木香根中的倍半萜类提取物）可以刺激永生化的人头皮毛囊真皮乳头细胞（hHFDPC）的增殖，并在进一步的动物实验中得到了验证，表明该成分具有显著的育发效果。永生化人角质细胞（HaCaT）和真皮乳头细胞（DP）被广泛地应用于育发和防脱发功效成分的筛选，多种植物提取物及化学合成物质在体外细胞和在进一步的动物实验中得到了一致的结果[39-41]。此外，由于白发的产生被认为与高氧化压力对黑色素的破坏有关，欧莱雅报道了采用过氧化氢损伤的人原代黑色素细胞模型用在乌发功效的评价上，如何首乌提取物被发现可有效抑制细胞内ROS水平升高和细胞凋亡，抑制氧化应激下黑色素的减少，从而起到乌发固色的作用[42]。

2.2 微生物模型

马拉色菌（Malassezia）与头皮屑的形成密切相关，头皮上真菌主要为马拉色菌，其中限制性马拉色菌（M.restricta）和球形马拉色菌（M.globaso）为优势种属[43]。因此，马拉色菌抑菌试验被广泛应用于添加了抗菌成分的去屑洗发水的功效评价。德国拜尔斯道夫公司[44]报道了通过对马拉色菌抑菌圈大小的测定，结合人体实验，比较含有不同抗菌原料（如吡罗克酮乙醇胺、氯胺酮和吡啶硫酮锌）洗发水的去屑功效。除了比较不同配方产品，马拉色菌实验还被广泛应用于抑菌去屑功效原料的筛选。多篇文献[45，46]报道了通过马拉色菌最小抑菌浓度（MIC）的测定筛选出了具有良好去屑抑菌性能的植物提取物（如茶树油、芦笋根提取物等）。这些植物成分可以作为化学抗菌剂的天然替代品用在去屑化妆品中。

2.3 组织模型

组织模型包含从人或者动物分离培养的毛囊体外培养系统和商业化的3D皮肤模型。与细胞系相比，这类组织模型在三维结构和生理功能等方面更接近真实人体，一般认为在功效评价时具有更高的可靠性。因此，近年来，体外毛囊培养系统在国内外被广泛应用于生发、育发药品及其育发类化妆品的研究与开发。Park等[47]报道了使用离体培养的人毛囊组织研究双-油酰氨基异丙醇（BOI）对毛发生长的影响，发现BOI处理能促进毛囊中的毛发生长并能将毛发的生长期由生长终期诱导转化为生长初期。此外，组织模型还可以与外源微生物共培养，进行包括抗菌、去屑功效的评价。2013年，联合利华报道了将马拉色菌接种于VitroSkinTM皮肤模型上，发现复配有抗菌成分（吡啶硫酮锌和甘宝素）的洗发水具有良好的去屑功效[44]。

3 发用化妆品体外功效评价方法汇总

与传统的动物和人体试验方法相比，以生物物理学仪器分析和离体生物学模型为代表的体外评价方法，具有经济、简便、快捷的优点，对于发用化妆品功效性原料的筛选、作用机理研究和配方的优化设计均具有重要的现实意义。表1总结了目前常用的发用化妆品的体外功效评价技术。其中，针对头发纤维部位的评价主要采用无损或微损的仪器分析，评价化妆品处理后头发纤维在颜色、亮度、微观结构、蛋白质损失和力学特性等方面的变化。对于作用部位在头皮的发用化妆品，其功效评价主要采用体外生物学模型。多种皮肤细胞、毛囊组织和微生物模型在育发、去屑类产品的功效评价中得到了广泛的应用。

表1 常用的发用化妆品功效评价的体外试验方法Tab.1 In vitro techniques commonly used for the efficacy evaluation of hair cosmetics

4 结语

发用化妆品功效复杂、种类繁多，单一的体外试验方法很难对产品进行全面评价。化妆品评价人员需要在掌握产品功效成分和作用机制的基础上，综合运用多种体外方法，将不同靶部位、不同层面的试验技术手段有机结合起来，才能实现对一款发用化妆品的多角度、系统性功效评价。与此同时，如何在已有体外方法的基础上，开发出适合临床的原位快速检测毛发理化性质及成分变化的试验技术也是未来发用功效评价发展的重要方向。